授精激活介质对大眼鳜精子活力的影响

摘要：以不同ｐＨ溶液、不同浓度的葡萄糖和Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋ 4种不同浓度金属离子及河水、曝气自来水、去离子水、蒸馏水４种水体作为授精激活介质，探讨大眼鳜（Ｓｉｎｉｐｅｒｃａ ｋｎｅｒｉ）精子在不同激活液中的活力变化。结果表明，ｐＨ为８．０时精子活力最强。大眼鳜精子的活力受葡萄糖、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋浓度的影响，葡萄糖浓度为１．５ ｇ／Ｌ时精子活力最强，Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋和Ｃａ２＋溶液浓度分别为７５、０．９、１５和１０ ｍｍｏｌ／Ｌ时精子活力最强。４种水体中精子活力由强到弱的顺序依次为蒸馏水、去离子水、曝气自来水和河水。

关键词：大眼鳜（Ｓｉｎｉｐｅｒｃａ ｋｎｅｒｉ）；精子活力；ｐＨ；葡萄糖；金属离子

中图分类号：Ｓ９６１．２＋２ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）19－4031-05

Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Mｅｄｉａ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｐｅｒｍ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｓｉｎｉｐｅｒｃａ ｋｎｅｒｉ

ＷＡＮＧ Ｆａｎｇ１，ＹＵＥ Ｘｉｎｇ－ｊｉａｎ１，ＸＩＥ Ｂｉ－ｗｅｎ１，ＱＩ Ｚｅ－ｍｉｎ１，ＷＡＮＧ Ｙｕ１，ＧＥ Ｚｈｅｎｇ－ｌｉａｎｇ２

（１． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅs， Ｎｅｉｊｉａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ / Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ， Ｎｅｉｊｉａｎｇ ６４１112， Ｓｉｃｈｕａｎ， Ｃｈｉｎａ；２． Ｔｈｅ Agrｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Fｉｓｈｅｒｙ Aｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Bｕｒｅａｕ ｏｆ Ｚｉｚｈｏｎｇ Cｏｕｎｔｙ ｉｎ Ｓｉｃｈｕａｎ Pｒｏｖｉｎｃｅ， Ｚｉｚｈｏｎｇ ６４１２００，Ｓｉｃｈｕａｎ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｓｉｎｉｐｅｒｃａ ｋｎｅｒｉ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｉｎ 4 different solutions and of ｔｈｅ ｒｉｖｅｒ ｗａｔｅｒ， ｔｈｅ ｔａｐ ｗａｔｅｒ， ｔｈｅ ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ， ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｗａｔｅｒｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ， ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ， Ｎａ＋，Ｋ＋，Ｃａ２＋ ａｎｄ Ｍｇ２＋． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｗａｓ ａｐｐｅａｒｅｄ ｉｎ ｐＨ ８．０； Ｔｈｅ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｓｉｎｉｐｅｒｃａ ｋｎｅｒｉ was ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ and the concentrations of Ｎａ＋，Ｋ＋，Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋， ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓ １．５ ｇ／Ｌ； Ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ was appeared when the concentrations of Ｎａ＋，Ｋ＋，Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋ｗｅｒｅ ７５，０．９，１５ ａｎｄ １０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ， ｔｈｅ ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ， ｔｈｅ ｔａｐ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｉｖｅｒ ｗａｔｅｒ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｔｒｅｎｄ ｆｒｏｍ ｓｔｒｏｎｇ ｔｏ ｗｅａｋ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓｉｎｉｐｅｒｃａ ｋｎｅｒｉ； ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ； ｐＨ； ｇｌｕｃｏｓｅ； ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ

大眼鳜（Ｓｉｎｉｐｅｒｃａ ｋｎｅｒｉ）隶属于鲈形目鲈亚目鮨科，地方名母猪壳、桂花鱼、刺薄鱼等，广泛分布于长江及黄河流域，是嘉陵江和沱江的主要经济鱼类之一，亦是深受人们喜爱的淡水珍贵食用鱼类之一。对大眼鳜的胚胎发育和早期生活习性等已有一些研究［１－３］，而对其精子活力的研究尚未见报道。由于金属离子、渗透压、温度、ｐＨ和单糖等均可以影响鱼类的精子活力和受精率［４－７］，因此在鱼类人工繁殖中常采用不同溶液作为授精和激活介质以提高受精率。本实验通过研究ｐＨ、葡萄糖和Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋ ４种金属离子及河水、曝气自来水、去离子水、蒸馏水４种水体对大眼鳜精子活力的影响，探讨大眼鳜精子在不同激活液中的活力变化，以期为大眼鳜人工繁殖中最佳授精激活介质的选择提供理论依据。

１材料与方法

１．１材料

２０１０年６月从沱江资中段采集自然流经的大眼鳜雄鱼，充氧运输至实验室，水族箱中暂养１ ｄ，充氧泵供氧。选择体长１８９～２３５ ｍｍ，体重１７８～２３５ ｇ，体质健壮的６尾雄性大眼鳜成鱼作为实验鱼。

１．２方法

１．２．１激活液的配制实验中所用化学试剂均为分析纯。为排除其他因素的干扰，所有溶液均用去离子水配成所需浓度。激活液的配制参照甘芳等［８］的方法。实验温度为２５ ℃，不考虑４种水体的ｐＨ值对精子活力的影响。

不同ｐＨ激活液的配制：取鱼用生理盐水（质量分数为０．６５％）用０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ或０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ配制成ｐＨ值为５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０共８个梯度的激活液，测定不同ｐＨ溶液对大眼鳜精子活力的影响。用ＰＢ－１０精密ｐＨ计测定溶液的ｐＨ值。

不同浓度葡萄糖溶液的配制：用葡萄糖配制１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、６．０ ｇ／Ｌ共８个浓度梯度，以去离子水作对照（ＣＫ），测定不同浓度葡萄糖溶液对大眼鳜精子活力的影响。

４种金属离子溶液的配制：Ｎａ＋组用ＮａＣｌ配制１０、２５、５０、７５、１００ ｍｍｏｌ／Ｌ 共５个浓度梯度；Ｋ＋组用ＫＣｌ配制０．１、０．３、０．５、０．７、０．９、１．０ mｍｏｌ／Ｌ共６个浓度梯度；Ｍｇ２＋组用ＭｇＣｌ２配制１、 ３ 、５、 １０、１５、２０ ｍｍｏｌ／Ｌ 共６个浓度梯度；Ｃａ２＋组用ＣａＣｌ２配制１、３、５、１０、１５、２０ ｍｍｏｌ／Ｌ共６个浓度梯度。以去离子水作对照（ＣＫ），测定不同浓度Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋溶液对大眼鳜精子活力的影响。

河水为内江段沱江水，去离子水、曝气自来水和蒸馏水均为实验室自制，测定不同水体对大眼鳜精子活力的影响。

１．２．２精液的采集用干毛巾擦去雄鱼生殖孔周围及体表水分，轻压腹部挤出精液，弃第一滴精液，用洁净吸管将精液移入１．５ ｍＬ冰浴离心管中备用。要求备检精液黏稠，呈乳白色，无水、无血、无尿、无粪便，遇水后迅速散开。

１．２．３精子活力观察用吸管吸一滴激活液于载玻片上，置于已调好焦距的显微镜下，用洁净牙签蘸取精液少许，与激活液混匀后立即观察记录其活动情况，并用秒表计时（精液与激活液相混时即开始计时）。用同一尾鱼的精液依次完成精子在一组激活液中的活动观测，且每个浓度梯度激活液取３尾鱼，每尾鱼重复３次，取９次的平均值作为观测值。

精子活力的计算参照苏德学等［９］的方法，即根据大眼鳜精子在水中的运动状态，将精子运动分为：①快速运动，精子运动速度很快，看不清运动路线；②中速运动，能看清精子运动轨迹，运动速度较慢；③慢速运动，精子缓慢地从一处游向另一处；④颤动，精子只在原地摇动，直至停止摇动。视野中７０％以上的精子从快速运动转入中速运动，即认为精子快速运动时间结束，９５％以上的精子停止颤动，即认为精子寿命终止。由于精子仅在快速运动时具有受精能力，因此本实验只计精子快速运动时间和精子寿命。

１．３数据分析

实验数据采用Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ ６．０软件进行统计分析，并利用单因素方差分析检验试验结果的差异显著性，用Ｄｕｎｃａｎ’ｓ多重比较法进行多重比较，采用Ｏｒｉｎｇｅ ７．０软件进行绘图。

２结果

２．１ｐＨ对大眼鳜精子活力的影响

ｐＨ对大眼鳜精子活力的影响见表１和图１。当ｐＨ值为８．０时，精子快速运动时间和寿命均最长，分别为（２７．７９±５．９２） ｓ和（４０．７３±７．２０） ｓ。ｐＨ 5.5~８．０时，快速运动时间和精子寿命大致上随ｐＨ值的增加而增加；ｐＨ ８．０~9.0时，随ｐＨ值的增加，精子快速运动时间和精子寿命均大幅度减少。ｐＨ值为８．０时，精子快速运动时间与ｐＨ值为８．５和９．０时差异显著（Ｐ＜０．０５），与其余各组差异不显著；ｐＨ值为８．０时，精子寿命与ｐＨ值为５．５、８．５、９．０时差异显著（Ｐ＜０．０５），与其余各组差异不显著。

２．２不同浓度葡萄糖溶液对大眼鳜精子活力的影响

不同浓度葡萄糖溶液对大眼鳜精子活力的影响见表２和图２。当葡萄糖浓度为１．５ ｇ／Ｌ时，精子快速运动时间和寿命均最长，分别为（２０．６７±２．６８） ｓ和（２８．２４±２．８１） ｓ。当葡萄糖浓度低于１．５ ｇ／Ｌ时，精子快速运动时间和寿命均随葡萄糖浓度的增加而增加；葡萄糖浓度高于１．５ ｇ／Ｌ时，则随葡萄糖浓度的增加而减少。葡萄糖浓度为１．５ ｇ／Ｌ时，精子快速运动时间与１．０、２．０及２．５ ｇ／Ｌ组差异不显著，与其余各组差异显著（Ｐ＜０．０５），精子寿命与１．０、２．０、２．５及３．０ ｇ／Ｌ组差异不显著，与其余各组差异显著（Ｐ＜０．０５）。

２．３不同浓度Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋溶液对大眼鳜精子活力的影响

不同浓度Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋溶液对大眼鳜精子活力的影响见表３和图３。大眼鳜精子快速运动时间和寿命随Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋浓度的增加呈先增加后减少的趋势。Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋溶液中精子快速运动的最长时间分别为（３２．４０±５．２５）、（２４．０３±２．８７）、（２０．２６±４．７６）、（２０．３０±３．６５） ｓ，对应的Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋浓度分别为７５、０．９、１５、１０ ｍｍｏｌ／Ｌ。Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋溶液中精子的最长寿命分别为（４９．２０±５．９５）、（３２．４２±１．７７）、（２９．３３±３．８０）、（２８．９９±３．１９） ｓ，对应的Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋浓度分别为７５、０．９、１０、１０ ｍｍｏｌ／Ｌ。Ｎａ＋浓度７５ ｍｍｏｌ／Ｌ组精子快速运动时间与对照组、１０及２５ ｍｍｏｌ／Ｌ组差异显著（Ｐ＜０．０５），与５０和１００ ｍｍｏｌ／Ｌ组差异不显著，７５ ｍｍｏｌ／Ｌ组精子寿命与１００ ｍｍｏｌ／Ｌ组差异不显著，与其余各组之间差异显著（Ｐ＜０．０５）。Ｋ＋浓度０．９ ｍｍｏｌ／Ｌ组精子快速运动时间及寿命与对照组和０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ组差异显著（Ｐ＜０．０５），与其余各组之间差异不显著。不同浓度Ｍｇ２＋各组之间精子快速运动时间和寿命均无显著差异。Ｃａ２＋浓度１０ ｍｍｏｌ／Ｌ组精子快速运动时间与１和２０ ｍｍｏｌ／Ｌ组差异显著（Ｐ＜０．０５），与其余各组之间差异不显著，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ组精子寿命仅与１ ｍｍｏｌ／Ｌ组差异显著（Ｐ＜０．０５）。

２．４河水、曝气自来水、去离子水和蒸馏水对大眼鳜精子活力的影响

河水、曝气自来水、去离子水和蒸馏水对大眼鳜精子活力的影响见表４。不同水体中大眼鳜精子快速运动时间和寿命由长到短依次为蒸馏水、去离子水、曝气自来水、河水。不同水体间精子快速运动时间和寿命均无显著差异。

３讨论

硬骨鱼类的精子在精巢和等渗电解质溶液中一般不活动，当排到体外被水或非等渗电解质溶液稀释后才被激活［１０］。鱼类精子的激活或抑制与渗透压、金属离子、ｐＨ值、单糖等因素有关［４－１０］。不同鱼类的精子具有不同的抑制与激活机制，其精子的活力与精子对渗透压和金属离子的敏感性有关。鲟鱼（Acipenser sturio）精子对Ｎａ＋和其他离子的敏感性主要由精浆的成分和Ｎａ＋含量决定［１１］，鲤科鱼类精子的抑制或激活主要是由渗透压决定的［６］。因此，研究理化因子对精子活力的影响对确定合理的精子授精激活介质及提高人工繁殖效率十分重要。

大眼鳜精子在中性或偏碱性的溶液中活力较高。鲑鳟鱼类输精管中的ｐＨ值和ＨＣＯ３－浓度明显较精小叶内高，生殖管道中精子活力的获得是ｐＨ值上升的结果［１２］。另有资料表明，鱼类精子的最适ｐＨ值与鱼类生活水域的ｐＨ值相当［１３］。大眼鳜精子激活的最适ｐＨ值为８．０，与目前的相关研究结果一致［１２－１４］。值得注意的是ｐＨ值５．５～８．０各组间大眼鳜精子活力无显著差异，表明大眼鳜精子对ｐＨ值适应性较强，与胭脂鱼（Ｍｙｘｏｃｙｐｒｉｎｕｓ ａｓｉａｔｉｃｕｓ）相似［１４］。酸性条件下精子活力较高的机制尚有待研究。

葡萄糖、果糖、半乳糖等单糖是鱼类精浆的重要组成成分［１５］，与哺乳动物一样，鲤鱼（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ ｃａｒｐｉｏ）精浆中具有碱性磷酸酶，能使来自血糖的６－磷酸葡萄糖和６－磷酸果糖转变为葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖在鱼类的精子中经三羧酸循环为精子运动提供能量［１６］。适宜浓度的葡萄糖可明显延长白斑狗鱼（Ｅｓｏｘ ｒｅｉｃｈｅｒｔｉ）［９］、丁■（Ｔｉｎｃａ ｔｉｎｃａ）［５］精子活动的时间。相同渗透压下，在葡萄糖溶液中精子的快速运动时间和寿命明显长于Na+溶液中，表明葡萄糖对精子活力的影响并不完全与渗透压有关，体外受精鱼类的精子可能还具有利用外源葡萄糖，补偿自身活动过程中消耗的部分能量的能力［５］。葡萄糖浓度对大眼鳜精子活力的影响与彩鲫（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ ａｕｒａｔｕｓ）［１７］相同，最适浓度均为１．５ ｇ／Ｌ，高于４．０ ｇ／Ｌ则会抑制精子的活动。大眼鳜精子的最适葡萄糖浓度远较大黄鱼（Ｐｓｅｕｄｏｓｃｉａｅｎａ ｃｒｏｃｅａ）［１８］和胭脂鱼［１４］的低，导致该差异的原因尚不清楚。

Ｎａ＋、Ｋ+、Ｍｇ２＋和Ｃａ２＋既是鱼类精浆的重要组成成分，也是构成精浆渗透压的主要离子，是影响鱼类精子活力的重要因素。在鲑鳟鱼类，Ｋ＋是抑制精子活力的主要因子，相反，在鲤科鱼类Ｋ＋则能提高精子的运动速度，延长精子运动时间［１９］，此外，Ｋ＋是维持日本鳗鲡（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｊａｐｏｎｉｃａ）精子活力的重要因子［２０］。Ｎａ＋、Ｍｇ２＋和Ｃａ２＋则能解除鲑鳟鱼类中Ｋ＋对精子活力的抑制作用，对精子活力具有促进作用［１１］。据报道，外部Ｃａ２＋是鲑鳟类、鲤科鱼类和鲟类精子激活的必要物质，鲑鳟类和鲤科鱼类精子激活时外界环境中的Ｃａ２＋可通过Ｃａ２＋通道进入精子细胞，使精子细胞中Ｃａ２＋浓度增加［２１］。此外，离子与渗透压对精子活力的影响是相互联系的，渗透压可改变质膜的结构和通透性，调节膜内外离子的浓度。本实验对大眼鳜精子活力的研究表明，适宜浓度的Ｎａ＋可以增强大眼鳜精子活力，其最适浓度为７５ ｍｍｏｌ／Ｌ，与淡水硬骨鱼类彩鲫［１７］、黄颡鱼（Ｐｅｌｔｅｏｂａｇｒｕｓ ｆｕｌｖｉｄｒａｃｏ）［２２］、美国大口胭脂鱼（Ｉｃｔｉｏｂｕｓ ｃｙｐｉｎｅｌｌｕｓ）［２３］、中华倒刺鲃（Ｓｐｉｎｉｂａｒｂｕｓ ｓｉｎｅｓｉｓ）［２４］及胭脂鱼［１４］一致，远较大黄鱼（３００ ｍｍｏｌ／Ｌ）［１８］、日本鳗鲡（４００～５００ ｍｍｏｌ／Ｌ）［２５］等海水鱼的低。但Ｋ＋促进大眼鳜精子活力的最适浓度为０．９ ｍｍｏｌ／Ｌ，远低于所有淡水硬骨鱼类（４７～８０ ｍｍｏｌ／Ｌ）［１４，１７］和海水硬骨鱼类（５００ ｍｍｏｌ／Ｌ左右）［１８］，出现此现象的原因可能是由于鮨科鱼类起源于浅海，其生理特征保留了祖先的较多特点［３］，具体生理功能的变化和适应有待进一步探究。不同浓度Ｍｇ２＋组及对照组对大眼鳜精子活力的影响无显著差异，与中华倒刺鲃［２４］相似。比较Ｍｇ２＋对硬骨鱼类不同物种精子活力的影响发现，不同物种间其最适Ｍｇ２＋浓度差异很大［２１－２５］。Ｃａ２＋对大眼鳜精子活力的影响与Ｍｇ２＋较为相似，促进大眼鳜精子活力的最适Ｃａ２＋浓度为１０ ｍｍｏｌ／Ｌ，且该最适浓度下精子的活力与对照组无显著差异。Ｎａ＋是激活大眼鳜精子的主要因子，Ｃａ２＋并非是大眼鳜精子激活的必需物质，比较Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋和Ｃａ２＋对大眼鳜精子活力的影响发现，不同浓度Ｎａ＋组中精子快速运动时间和精子寿命均高于对照组和最适Ｋ＋、Ｍｇ２＋和Ｃａ２＋浓度组。

Ｃｏｓｓｏｎ等［１０］认为鱼类排精的自然水体并不一定是适宜的精子激活液。用河水激活大眼鳜精子的活力低于去离子水、曝气自来水和蒸馏水激活的活力，进一步证实了Ｃｏｓｓｏｎ的观点。

综上所述，大眼鳜人工授精时授精激活液宜采用蒸馏水配制，溶液ｐＨ值为８．０，且应含Ｎａ＋ ７５ ｍｍｏｌ／Ｌ、 Ｋ＋ ０．９ ｍｍｏｌ／Ｌ、 Ｍｇ２＋ １５ ｍｍｏｌ／Ｌ、 Ｃａ２＋ １０ ｍｍｏｌ／Ｌ和葡萄糖１．５ ｇ／Ｌ。

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