棉铃虫类胰蛋白酶的生物信息学分析

摘要：对棉铃虫（Helicoverpa armigera L.）肠道内7种类胰蛋白酶的氨基酸序列进行了生物信息学分析。结果表明，棉铃虫7种类胰蛋白酶理化性质相近，含有丰富的Ala、Cys、Gly与Thr，均为可溶性蛋白酶，不稳定性较高。类胰蛋白酶分子中不存在跨膜结构域，含有特定的磷酸化位点，主要分布在细胞外基质与内质网中。棉铃虫类胰蛋白酶属于胰蛋白酶超家族成员，具有较高的氨基酸序列同源性，分子中含有保守的必需氨基酸残基，参与维持蛋白酶的空间结构及行使催化功能。分子进化研究表明类胰蛋白酶Ⅲ与类胰蛋白酶Ⅵ进化关系较近，而类胰蛋白酶Ⅰ和类胰蛋白酶Ⅱ在进化关系上更为接近。无规卷曲结构是类胰蛋白酶二级结构中的主要结构元件。

关键词：棉铃虫（Helicoverpa armigera L.）；类胰蛋白酶；生物信息学；分析

中图分类号：S433.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）20-5047-04

Bioinformatics Analysis of Putative Trypsins of Helicoverpa armigera

LONG Ting，LEI Jie-ping，SONG Tao，HE Li-ran，ZHOU Jia-yu，LIAO Hai

（College of Life Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，Chengdu 611756，China）

Abstract： Bioinformatic methods were used to analyze the amino acid sequences of 7 putative trypsins in the midgut of Helicoverpa armigera. The results showed that physical and chemical characteristics of these trypsins were very similar. Ala，Cys，Gly and Thr were abundant in these trypsins. These trypsins were soluble and relatively instable. They had no transmembrane structure and each trypsin had specific phosphorylation sites. They were mainly located in the extracellular and endoplasmic reticulum. These trypsins were belonged to the trypsin super family with highly homologous amino acid sequences. These trypsins consisted conservative residues participated in maintaining tertiary structure and catalytic process. Phylogenetic tree analysis showed that trypsin Ⅲ was similar to trypsin Ⅵ，and trypsin Ⅰ was more close to trypsin Ⅱ. Random coils were the major element in the whole secondary structure of these trypsins.

Key words： Helicoverpa armigera L.； putative trypsin； bioinformation； analysis

棉铃虫（Helicoverpa armigera L.）属鳞翅目夜蛾科，是世界性重大致灾害虫之一。棉铃虫为多食性害虫，寄主植物有20多科200余种，可危害棉花、烟草、小麦、玉米、高粱、番茄、豆类、瓜类等多种农作物，给农业生产带来严重威胁[1]。类胰蛋白酶是棉铃虫幼虫中肠内最主要的消化酶，其主要功能是参与棉铃虫中肠内不同类型消化酶的激活及对食物蛋白质的消化，使棉铃虫能够获取生长发育所需的必需氨基酸[2，3]。类胰蛋白酶还能够参与棉铃虫对外界环境的免疫应答[4]。由于类胰蛋白酶在棉铃虫营养消化及免疫防御方面的重要地位，以类胰蛋白酶为作用靶点筛选抗虫基因或蛋白质成为生物学研究的一大热点，如植物胰蛋白酶抑制剂能够抑制棉铃虫中肠类胰蛋白酶的活力，是具有较好抗棉铃虫应用潜力的候选抗虫因子。通过转基因技术将胰蛋白酶抑制剂基因转入到异源植物中，培育抗棉铃虫植物新品种也取得了良好的进展[5-8]。

然而，棉铃虫中肠内至少存在7种类胰蛋白酶，它们在棉铃虫不同发育时期的作用、表达模式及对胰蛋白酶抑制剂的敏感度不尽相同。这种差异主要来源于类胰蛋白酶结构上的不同[4，6，9，10]。本研究利用生物信息学方法分析棉铃虫7种类胰蛋白酶的理化性质；进行序列比对，分析其一级结构中的关键氨基酸；依据氨基酸水平上的异同分析，研究类胰蛋白酶的起源进化和结构、功能的演变，进而寻找其间的亲缘关系；研究其跨膜结构域，预测其可能作用位点；进行功能结构域分析，筛选关键的功能区域，为系统认识类胰蛋白酶的结构与酶促机制，并为筛选以类胰蛋白酶为作用靶点的有效抗虫功能蛋白质或基因的筛选提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验数据来源于GenBank数据库和NCBI蛋白质数据库中已登录的棉铃虫类胰蛋白酶的氨基酸序列，包括类胰蛋白酶Ⅰ（HaTS7，CAA72950.1）、类胰蛋白酶Ⅱ（HaTC11， CAA72948.1）、类胰蛋白酶Ⅲ（SR36，CAA72956.1）、类胰蛋白酶Ⅳ（SR28，CAA72955.1）、类胰蛋白酶Ⅴ（HaTC16，CAA72949.1）、类胰蛋白酶Ⅵ（SR24，SR40，CAA72954.1）、类胰蛋白酶Ⅶ（SR66，CAA72962.1）。

1.2 方法

试验主要采用各种生物在线工具及软件来处理相关氨基酸序列，进行整理、比较、预测。运用NCBI数据库中BLAST在线工具进行棉铃虫类胰蛋白酶序列筛选；运用ProtParam在线软件（Physico-chemical parameters of a protein sequence；http：//expasy.org/tools/protparam.html）分析棉铃虫类胰蛋白酶氨基酸序列的理化性质；运用DNAMAN软件比对分析氨基酸序列同源性；运用MEGA 5.0中的Fhylogenetic Tree方法构建分子系统发育树；运用在线工具ProtScale （http：//.cn/qkpdf/hbny/hbny201320/hbny20132055-1.pdf" style="color:red" target="_blank">原版全文

2.6 棉铃虫类胰蛋白酶的亚细胞定位分析

亚细胞定位预测结果见表3。由表3可以看出，类胰蛋白酶Ⅰ、Ⅱ主要位于内质网中，类胰蛋白酶Ⅲ主要位于内质网、液泡及细胞外基质中，而类胰白酶Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ与Ⅶ主要位于细胞外基质中。亚细胞定位的多样性体现了类胰蛋白酶在棉铃虫生命活动过程中具有多样性的生物学功能，其中类胰白酶Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ与Ⅶ主要发挥消化作用，因为棉铃虫对食物的消化场所主要位于中肠（细胞外）。而类胰蛋白酶Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ可能主要行使免疫保护作用，参与棉铃虫对外界环境的免疫应答。

2.7 棉铃虫类胰蛋白酶的二级结构分析预测

利用NPSA在线工具预测类胰蛋白酶的二级结构（表4）。由表4可知，无规卷曲是该类胰蛋白酶整体结构中的主要组成结构元件，β转角出现概率相对较小。α螺旋主要分布于氨基酸序列两侧，而无规卷曲、延伸链则主要分布在多肽链中间区段。

3 小结与讨论

本研究以棉铃虫肠道内7种类胰蛋白酶为研究对象，运用在线工具对其进行生物信息学分析。结果表明，7种类胰蛋白酶理化性质较为相似，为亲水性蛋白酶。Ser是类胰蛋白酶序列中磷酸化概率最大的氨基酸残基。分子系统发育树结果显示类胰蛋白酶Ⅲ与类胰蛋白酶Ⅵ进化关系较近，而类胰蛋白酶I和类胰蛋白酶Ⅱ在进化关系上更为接近。类胰蛋白酶不存在跨膜结构域，属于基质类蛋白，这与其亲水性的特点吻合。功能结构域分析发现类胰蛋白酶属于胰蛋白酶超家族，其氨基酸序列中含有自切割位点、若干催化残基与结合残基。类胰蛋白酶的亚细胞定位具有多样性，主要分布在细胞外与内质网中，这体现了类胰蛋白酶在棉铃虫生命活动过程中具有多样性的生物学功能。二级结构分析预测表明无规卷曲在该类胰蛋白酶整体结构中所占比例最大，是其主要的结构元件。氨基酸序列同源性分析，7种类胰蛋白酶氨基酸序列的同源性较高，达到了85.71%，并且含有高度保守的必需残基，参与维持蛋白酶的空间结构及行使催化功能，包括维持高级结构的Cys残基，形成底物结合口袋的结合残基及参与催化作用的催化残基。依据此研究结果，能够设计出与类胰蛋白酶活性中心特异性结合的抑制剂，抑制其活性，从而扰乱棉铃虫的正常消化，实现抗虫目的。

参考文献：

[1] 常团结，陈 蕾，路子显，等. 棉铃虫幼虫中肠类胰蛋白酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[J]. 动物学报，2002，48（6）：790-796.

[2] 任晓霞，韩召军，王荫长. 棉铃虫乙酰胆碱酯酶cDNA片段的克隆和序列分析[J]. 动物学报，2002，48（1）：121-124.

[3] 郭线茹，蒋金炜，罗梅浩，等. 转基因抗虫烟草研究进展[J]. 昆虫知识，2005，42（4）：358-363.

[4] CHOUGULE N P， GIRI A P，SAINANI M N， et al. Gene expression patterns of Helicoverpa armigera gut proteases[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology，2005，35（4）：355-367.

[5] KANG Z， JIANG J H， WANG D， et al. Kunitz-type trypsin inhibitor with high stability from Spinacia oleracea L. seeds[J]. Biochemistry （Moscow），2009，74（1）：102-109.

[6] TELANG M A， GIRI A P， SAINANI M N， et al. Characterization of two midgut proteinases of Helicoverpa armigera and their interaction with proteinase inhibitors[J]. Journal of Insect Physiology，2005，51（5）：513-522.

[7] TAMHANE V A， CHOUGULE N P， GIRI A P， et al. In vivo and in vitro effect of Capsicum annum proteinase inhibitors on Helicoverpa armigera gut proteinases[J]. Biochim Biophys Acta，2005，1772（2）：156-167.

[8] BOWN D P， GATEHOUSE J A. Characterization of a digestive carboxypeptidase from the insect pest corn earworm （Helicoverpa armigera） with novel specificity towards C-terminal glutamate residues[J]. European Journal of Biochemistry，2004， 271（10）：2000-2011.

[9] VOLPICELLA M， CECI L R， CORDEWENER J， et al. Properties of purified gut trypsin from Helicoverpa zea adapted to proteinase inhibitors[J]. Eur J Biochem，2003，270（1）：10-19.

[10] LOPEZ A R， JULIANO M A， JULIANO L， et al. Coevolution of insect trypsins and inhibitors[J]. Arch Insect Biochem Physiol，2004，55（3）：140-152.

推荐访问:棉铃 胰蛋白酶 信息学 生物 分析

---