细针吸取细胞学结合PCR法在淋巴结结核诊断中的应用及其与传统微生物检测方法的比较

[摘要] 目的 研究对比162例淋巴结结核的诊断方法。 方法 选取浙江省金华市中心医院于2008年1月～2010年6月经细针穿刺细胞学诊断淋巴结结核或可疑结核的病例，穿刺组织同时进行抗酸染色、细菌培养及PCR扩增检测结核分枝杆菌DNA（TB—DNA）。 结果 TB—DNA阳性117例，阳性率为72.2%；抗酸染色阳性71例，阳性率为43.8%；细菌培养阳性99例，阳性率为61.1%；在61例FNAC直接诊断结核的病例，PCR及细菌培养阳性率明显高于抗酸染色（χ2值均为13.739，P < 0.01），在101例FNAC诊断为可疑结核或不排除结核的病例，PCR阳性率高于细菌培养及抗酸染色（χ2值分别为6.706、13.612，P均<0.01）；抗酸染色及细菌培养阳性的病例TB—DNA均阳性； FNAC结合PCR结果可明确诊断80.9%结核。 结论 FNAC是诊断淋巴结结核简便有效的方法， PCR扩增高效、快速、敏感、特异，可作为FNAC诊断结核很好的补充，FNAC结合PCR技术是较好的淋巴结结核的诊断方法。

[关键词] 细针穿刺；细胞学；聚合酶链反应；结核；淋巴结

[中图分类号] R522 [文献标识码] B [文章编号] 1673—9701（2012）26—0021—03

Comparative evaluation of the diagnostic method in 162 cases of tuberculous lymphadenitis

WANG Lixia1ZHU Fang1SHEN Wei2ZHU Yijun3

1.Department of Pathology， Jinhua Central Hospital in Zhejiang Province， Jinhua321000， China；2.Department of Hepatobiliary Surgery， Jinhua Central Hospital in Zhejiang Province， Jinhua321000， China；3.Department of Laboratory， Jinhua Central Hospital in Zhejiang Province， Jinhua321000， China

[Abstract] Objective To evaluate the diagnostic method in 162 cases of tuberculous lymphadenitis. Methods A—total of 162 cases of tuberculous lymphadenitis were performed by fine needle aspiration cytology（FNAC），as well as acid—fast bacillus stain（AFB）， culture and PCR； Results Among the 162 cases， 117 cases were TB—DNA positive（117/162，72.2%）， while the positivity of AFB was 43.8% （71/162），and culture was 61.1%（99/162）； In 61 definitely diagnosed tuberculous lymphadenitis by FNAC cases， the positive rate of PCR and of culture were significantly higher than which of AFB （P < 0.01）， and in 101 cases which diagnosed suspiciously， the positive rate of PCR was higher than which of AFB and culture （P < 0.01）.The positive cases of AFB and culture were all TB—DNA positive； FNAC combined with PCR can diagnose 80.9% tuberculous lymphadenitis clearly. Conclusion FNAC combined with PCR to test TB—DNA is the most simple and effective diagnostic method of tuberculous lymphadenitis.

[Key words] Fine needle aspiration；Cytology；Polymerase chain reaction；Tuberculosis；Lymph node

结核病可通过空气经呼吸道传播，目前全球结核病疫情仍相当严峻[1]。我国为世界第二大“结核国”，仅次于印度。近年来肺外结核病的发病率呈明显上升且持续上升趋势，主要又以浅表淋巴结结核为首，因此探索一种简便有效的淋巴结结核的确诊方法是迫切而首要的任务。现将我院于2008年1月～2010年6月诊断为淋巴结结核的162例病例情况总结分析，探讨各诊断方法的优越性及局限性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 收集浙江省金华市中心医院2008年1月～2010年6月诊断为淋巴结结核的162例病例材料。临床表现为浅表淋巴结肿大，其中男67例，女95例，年龄2～89岁，平均38.2岁，中位年龄42岁。肿块部位为颈部者88例，其余锁骨上36例，腋下11例，颌下13例，胸壁6例，腹股沟5例，腰背部2例，臀部1例。详细询问病史，23例曾有结核病史，正在服用抗结核药物或曾经服用抗结核药物，4例于当地卫生院颈部肿块切除，术后肿块复发并红肿，硬结，化脓。所有病例电话随访6个月以上，56例进行结核菌素（PPD）试验阳性；44例胸片显示肺部结核病灶；87例正规抗结核治疗并显效（肿块缩小、消失）。

1.1.2 仪器与试剂 LightCycler PCR扩增仪为美国罗氏公司产品；PCR试剂为中山大学达安基因股份有限公司产品；抗酸染色液为珠海贝索生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集 肿块局部皮肤常规消毒，采用10 mL一次性注射器（针头22G），左手固定肿块，右手保持负压在肿块内反复多方向提插数次，去负压，分离针头针筒，拔出针头，将吸出物打在载玻片上，涂片24张，一张稍干燥用于抗酸染色，其余立即用95%乙醇固定，然后HE染色镜检。用细胞学剩余材料或重新穿刺材料进行PCR扩增及结核杆菌培养

1.2.2 PCR法检测TB—DNA 将穿刺标本用无菌生理盐水洗涤2次，取50 μL沉渣悬液加50 μL lDNA提取液充分混匀，置100℃沸水浴中10 min，取出后置4℃，6～8 h以保证充分裂解。10000 rpm离心5 min，取上清液2 μL加入专用毛细管中，4000 rpm离心3 min，插入圆形卡盘倒置20 s后放入仪器中设置循环条件为93℃，2 min预变性，然后经93℃，5 s；57℃，45 s，共40个循环，37℃延伸1 min。另取阴性质控品、阳性质控品各40μL加等量DNA提取液打匀，沸水浴10min后同上处理。反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光记数值为F1/F2，点击Quantification读取结果。以Ct（Cycle threshold）值判断结果，Ct值<40为阳性，Ct值≥40为阴性。

1.2.3 抗酸染色法找抗酸杆菌 按照试剂说明书进行。主要步骤如下：（1）初染：涂片上滴加石碳酸复红液，用火焰加热至产生蒸汽，约5 min（防止染液蒸干），水洗。（2）脱色：第二液（3%盐酸乙醇）脱色约1 min，轻轻摇动玻片至涂片无红色脱出或略显粉红色时为止，水洗。（3）复染：第三液（吕氏美蓝复染液）复染30 s，水洗。自然干燥后镜检。抗酸杆菌染成红色，非抗酸杆菌为蓝色。

1.2.4 结核杆菌细菌培养 （1）前处理：视标本性状，加1～2倍体积4%氢氧化钠（NaOH）消化液于标本瓶中，涡旋振荡器振荡2～3 min，使标本充分匀化，室温放置。（2）接种：吸取经前处理后的标本0.1 mL，均匀接种在整个培养基斜面。每份标本接种两支酸性罗氏培养基。接种后，37℃平卧放置斜面24 h。然后拧紧培养瓶盖或塞紧试管胶塞，直立放置，37℃继续培养。（3）结果与报告：接种后第3天、第7天各观察1次。3 d发现菌落生长者，经抗酸染色证实后，可报告快速生长抗酸杆菌。以后每周观察1次，记录菌落生长及污染情况。阳性生长物经抗酸染色证实后，可报告抗酸杆菌生长。培养阴性结果须在满8周时即第9周开始时仍未见菌落者方可报告。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件包进行统计学处理。不同检测方法阳性率的比较采用卡方检验。

2 结果

细针穿刺细胞学（（Fine needle aspiration cytology，FNAC）诊断结核的主要依据是涂片中找到干酪样坏死物、朗罕细胞和类上皮细胞，若三者同时见于淋巴结穿刺涂片，即可诊断淋巴结结核[2]。本组162例，FNAC直接诊断淋巴结结核61例，占37.7%，其它101例可见肉芽肿性病变或坏死性病变，诊断为可疑结核或不排除结核，进一步病原学检查阳性和/（或）伴有肺部病灶、PPD实验阳性及抗结核治疗有效。

162例穿刺涂片抗酸染色，涂片通过1000倍油镜仔细查找，发现染成紫红色棒状，弯曲杆状细菌为阳性，见图3，抗酸杆菌可散在数条或小簇散布。162例抗酸染色阳性71例，阳性率43.8%。穿刺物PCR扩增结核分枝杆菌TB—DNA，电脑自动判读结果，阳性病例可见扩增曲线见图4，TB—DNA阳性117例，阳性率为72.2%。结核杆菌培养需特殊培养基，菌落生长似奶酪，见图5。细菌培养阳性99例，阳性率为61.1%。各项病原学检测结果与FNAC诊断结果的对比见表1。

表1162例结核FNAC诊断与抗酸染色、细菌培养、PCR检测结果的比较

可见在FNAC明确诊断的病例，PCR及细菌培养阳性率明显高于抗酸染色（χ2值均为13.739，P < 0.01），在101例FNAC未直接诊断结核的病例，PCR阳性率高于细菌培养及抗酸染色（χ2值分别为6.706、13.612，P均<0.01）。另外71例涂片找到抗酸杆菌的病例细菌培养及PCR结果均阳性，而99例细菌培养阳性的病例TB—DNA均阳性。FNAC直接诊断淋巴结结核的61例，占37.7%，FNAC结合PCR结果可明确诊断结核的为131例，占80.9%。

根据FNAC镜下所见可分为增殖型：呈肉芽肿样改变，可见小巢和散在杵状、黄瓜状上皮样细胞和/（或）郎罕细胞（图1）。有反应性淋巴细胞，未见干酪样坏死组织；增殖伴坏死型：在增殖型涂片基础上可见不同数量淡染嗜伊红的无定形物质；干酪样坏死型：见大量淡染嗜伊红的坏死组织或水样坏死无定形物（图2）。背景中可见残存的淋巴细胞，伴发感染时可见多量中性粒细胞。其各项病原学检测结果见表2。从表2可见抗酸染色，细菌培养及PCR检测结果阳性率在没有坏死的增殖型明显低于坏死型及伴有坏死的增殖型（χ2值分别为6.786，13.183，13.739，P均 < 0.01），而三者阳性率在增殖坏死型及干酪样坏死型间无明显差异（χ2值分别为2.973，2.981，3.001，P均>0.05）。

表2FNAC分型与抗酸染色、细菌培养、PCR检测结果的关系[n（%）]

3 讨论

由于人类艾滋病病毒和耐药结核菌株的产生等原因，全球结核病疫情明显上升并呈持续上升趋势[3]。世界卫生组织于2006年发起防治结核病全球计划。我们的实验旨在探索一种简便有效的淋巴结结核的确诊方法。

细针穿刺细胞学（FNAC）是近年发展迅速的一种简便、安全、快速的诊断方法，克服了外科取活检组织损伤大，伤口不易愈合，还可能形成窦道，瘘等后遗症的缺点。Balaji等[4]认为FNAC诊断淋巴结结核的准确性接近活检。我们的数据显示，162例淋巴结结核通过FNAC能直接确诊的为61例，其余101例诊断为可疑结核或不排除结核，一般情况下需进一步提供病原性依据，才可进行正规抗结核治疗。我们的结果还显示，在FNAC明确诊断的病例，PCR及细菌培养阳性率明显高于抗酸染色（χ2均为13.739，P < 0.01），在FNAC未直接诊断结核的病例，PCR阳性率高于细菌培养及抗酸染色（χ2分别为6.706、13.612，P均 < 0.01 ）。另外抗酸染色及细菌培养阳性的病例TB—DNA均阳性，只要FNAC结合PCR可明确诊断80.9%结核，这与相关报道一致。

Honore—Bouakline等[5]认为肺外结核细菌含量通常较少，抗酸染色和细菌培养假阴性较高。Tiwari等[6]发现送检材料细菌含量在（10000～100000）/mL时，涂片上才能检到细菌。文献报道细针穿刺涂片抗酸杆菌检出率在0～77.8%，我们的结果与Mirza等[7]的42%接近。细菌培养的阳性率也报道不一，Pahwa等[8]的结果仅为22%，我们的结果与Mittal等[9]的60%接近。因为聚合酶链反应（PCR）检测的是结核分枝杆菌染色体特异的DNA片段，不受各种分枝杆菌菌种的影响，它可在短时间内将极微量靶DNA特异地扩增百万倍以上，大大提高对DNA的检出能力，所以即使18例培养阴性的病例PCR结果仍阳性，并且抗酸染色和培养阳性的病例PCR无一阴性，可见PCR结果的高效性和敏感性。本组数据仍有44例PCR结果阴性，分析可能的原因为本组病例有23例服用或服用过抗结核药物，细菌大部分已消灭，另外穿刺时出血明显或穿刺物位于坏死中心部位可干扰DNA的提取以及增殖型病例细菌被杀灭等。

我们的结果还显示，抗酸染色、细菌培养及PCR结果均与FNAC的分型相关， 17例增殖型仅有2例PCR结果阳性，抗酸染色和细菌培养无一例阳性，这与该型细菌量少、毒力低而人体免疫力强，细菌在结核结节形成过程中被清除有关，与结核病的基本病理变化相吻合。

相关报道对淋巴结结核的诊断方法已做比较[1，9—11]。我们认为FNAC是诊断淋巴结结核安全有效的方法，同时还为生物学材料的获取提供一种简便途径；涂片抗酸染色是廉价简便的方法，但敏感性稍低；细菌培养曾被认为是金标准，但费时费力，假阴性率仍较高； PCR扩增高效、快速、敏感、特异，可作为FNAC诊断结核很好的补充。

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[3] Schluger NW，Burzynski J. Tuberculosis and HIV Infection： Epidemiology，Immunology，and Treatment[J]. HIV Clin Trials，2001，4（2）：356—360.

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[5] Honore—Bouakline S，Vincensini JP，Giacuzzo V，et al. Rapid diagnosis of extrapulmonary tuberculosis by PCR：Impact of sample preparation and DNA extraction[J]. J Clin Microbiol，2003，6（41）：2323—2329.

[6] Tiwari RP，Hattikudar NS，Bharmal RN，et al. Modern approaches to a rapid diagnosis of tuberculosis：Promises and challenges ahead[J]. Tuberculosis，2007，87（1）：193—201.

[7] Mirza S，Restrepo BI，Mccormick JB，et al. Diagnosis of tuberculosis lymphadenitis using a polymerase chain reaction on peripheral blood mononuclear cells[J]. Am J Trop Med Hyg，2003，69（5）：461—465.

[8] Pahwa R，Hedau S，Jain S，et al. Assessment of possible tuberculous lymphadenopathy by PCR compared to non—molecular methods[J]. J Med Microbiol，2005，54（9）：873—878.

[9] Mittal P，Handa V，Mohan H，et al. Comparative evaluation of fine needle aspiration cytology，culture，and PCR in diagnosis of tuberculous lymphadenitis[J]. Diagn Cytol，2011，39（11）：822—826.

[10] Aljafari AS，Khalil EA，Elsiddig KE，et al. Diagnosis of tuberculous lymphadenitis by FNAC，micmbiological methods and PCR：a comparative study[J]. Cytopathology，2004，15（1）：44—48.

[11] Nataraj G，Kurup S，Pandit A，et al. Correlation of fine needle aspiration cytology，smear and culture in tuberculous lymphadenitis：A prospective study[J]. J Postgrad Med，2002，48（2）：113—116.

（收稿日期：2012—05—24）

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