细胞DNA倍体分析联合高危HPV,DNA核酸检测在子宫颈鳞状上皮高级别内病变筛查中的应用研究

【摘要】 目的：探讨细胞DNA倍体分析联合高危HPV DNA核酸检测在子宫颈鳞状上皮高级别内病变筛查中的应用价值。方法：选取2015年8月-2017年2月就诊于笔者所在医院的宫颈疾病患者260例。所有患者均同时给予细胞DNA倍体分析、高危HPV DNA核酸两种方式单一或联合检测。以阴道镜病理活检为金标准，比较高危HPV DNA核酸检测、细胞DNA倍体分析单独或联合检测的灵敏度、特异度、准确度。结果：两种方式联合检测子宫颈上皮内病变的灵敏度、特异度、准确度分别为85.64%、92.31%、86.54%，其中特异度与准确度明显高于高危HPV DNA检测的41.54%、78.46%及细胞DNA倍体分析的86.15%，81.15%，差异均有统计学意义（P<0.05）；联合检测灵敏度略低于高危HPV DNA检测的90.77%，差异无统计学意义（P>0.05）；但明显高于细胞DNA倍体分析的78.46%，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：细胞DNA倍体分析联合高危HPV DNA核酸检测可显著提高早期宫颈病变诊断的准确度，改善筛查工作质量，有助于防治宫颈癌，提升医疗卫生水平。

【关键词】 宫颈病变； 细胞DNA倍体分析； 人乳头状瘤病毒； 筛查

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.31.038 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2017）31-0076-03

宫颈持续感染HPV是导致正常宫颈发生恶性病变的关键因素，在一百多种亚型中，约有30种具有致癌性，其中16型、18型、33型等十四种HPV亚型因与宫颈癌具有紧密的关系而被称为高危型HPV[1]。受人体免疫等影响，绝大多数HPV感染者1～2年内即可自动清除HPV病毒，低级别的宫颈上皮病变可自行消退，因而癌变发生的可能性较小，但仍有小部分患者因持续感染HPV最终进展为宫颈癌。大约有8～10年的癌前病变时期，故在发展为宫颈癌之前从早期筛查中发现宫颈癌前病变，尤其是发现宫颈高级别上皮内病变，及时阻断病情发展，具有重大的临床意义。HPV DNA检查是宫颈癌筛查中较为常见的一种手段，尤其适用于发展中国家[2-3]。但有研究显示，HPV 属于病因，无法确定病毒活性及病变严重性，且绝大多数属于一过性感染，多数感染HPV的女性并不会发展为CIN或宫颈癌，灵敏度虽高，但特异性低，因而不利于评估宫颈病变的进展情况。另外，越来越多报道表明，仅依靠HPV检测进行ASCUS分流可能导致部分高级别宫颈病变漏诊，因可能存在与HPV感染无关的宫颈病变，或HPV清除前已出现不可逆的宫颈病变，或存在HPV假阴性等[4]。DNA倍体分析属于筛查早期宫颈病变的新型技术，为宫颈癌的筛查指出了新的方向，但因受制于取材、制片及病理医师的判读水平高低，细胞学检查常伴有假阴性[5]。因此本文意将细胞DNA倍体分析联合高危HPV DNA核酸检测对早期的宫颈病变进行筛查研究，旨在对不同患者进行分流诊治，及时发现宫颈上皮高级别内病变，阻断病情发展，降低宫颈癌的病发率，进一步改进宫颈病变筛查工作质量。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

選择2015年8月-2017年2月就诊于笔者所在医院妇科的宫颈疾病患者260例，年龄25～65岁，平均（39.76±4.29）岁。临床症状表现为接触性出血、阴道异常出血、白带异味、白带增多、下腹部疼痛、外阴瘙痒等。

1.2 方法

1.2.1 取样方法 非经期采样，患者取膀胱截石位，采用窥阴器直视宫颈，用棉球将过多的粘液与分泌物拭去，于宫颈内放入专用采样器，将其向前轻柔抵住，旋转3～5周，轻缓取出采样器，刷头置入保存液内，取样管瓶盖拧紧后，贴上标签送检。

1.2.2 检测方法

1.2.2.1 高危HPV DNA 核酸检测 采用罗氏Cobas 4800系统及相应的试剂盒检测HPV DNA亚型。检测将所需洗液、样本制备试剂、样本提取试剂、阴阳性质控从冰箱取出，平衡30 min至室温。将样本充分振荡混匀后转移至二极导管，至少保证体积1.0 ml，随后将编号后的二极管放置于样本架，并上载到cobas x480轨道上，随即可进行全自动核酸提取。待HPV DNA提取成功后手动取出微孔板，封膜，转移至cobas z 480进行核酸扩增和荧光检测，最后由系统软件给出结果，报告结果为HPV16（+/-）、HPV18（+/-）、其他12型高危（+/-）。

1.2.2.2 细胞DNA倍体分析 将标本振荡，离心5 min（800 rpm），50%乙醇清洗，离心2次，弃上清液，加固定剂2～3 ml，振荡，混匀，加200 μl细胞悬液入细胞离心管，离心、甩片5 min，制成液基薄层细胞片2张。1张采用巴氏染色做常规细胞学检查，由具有资质的病理医师阅片，采用TBS系统对结果进行分级判断，细胞学结果异常的需经病理主任医师确认。另1张采用Feulgen染色进行DNA倍体分析，采用厦门麦克奥迪医疗诊断系统有限公司提供的全自动细胞DNA倍体定量分析仪及全自动图片分析系统。

1.2.2.3 宫颈病理活检 将≥3个DNA异常倍体细胞标本或细胞学诊断判读为Aucus以上的行电子阴道镜及宫颈活组织病理检查。宫颈组织病理活检结果以WHO子宫颈肿瘤组织学分类标准报告，结果包括正常/慢性炎症、宫颈上皮低级别内病变（CINⅠ）、宫颈上皮高级别内病变（CINⅡ和CINⅢ）和宫颈浸润癌。

1.3 观察指标

根据阴道镜病理活检为诊断金标准，DNA倍体分析诊断标准：病变细胞（DI≥2.5）≥3个或细胞学诊断判读为Aucus以上，高危HPV DNA核酸检测结果由Cobas系统给出：HPV16（+/-）、HPV18（+/-）、其他12型高危（+/-）。二者联合诊断以阴道镜病理活检为诊断金标准，比较高危HPV DNA核酸检测，细胞DNA倍体分析单独检查及两者联用时的灵敏度、特异度及准确度。比较高危HPV DNA核酸检测，细胞DNA倍体分析单独检查及两者联用时的灵敏度、特异度及准确度。其中灵敏度=真阳性/（真阳性+假阳性），即与病理诊断阳性符合的例数/病理诊断阳性例数；特异度=真阴性/（真阴性+假阴性），即与病理诊断阴性符合的例数/病理诊断阴性例数；准确度=（真阳性+真阴性）/（真阳性+真阴性+假阳性+假阴性），即与病理诊断阳性、阴性符合的例数/病理诊断总例数。

1.4 统计学处理

采用SPSS 21.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验；计数资料以率（%）表示，采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

260例患者经阴道镜病理诊断显示，正常或宫颈炎症65例，子宫颈鳞状上皮病变195例，其中低级别病变102例，高级别病变85例，宫颈癌8例。两种方式联合检测出子宫颈上皮内病变的特异度、准确度均明显高于高危HPV DNA 核酸与细胞DNA倍体分析分别单独检测，差异有统计学意义（P<0.05），见表1、表2、表3、表4。

3 讨论

HPV DNA分型检测旨在从分子生物学水平对宫颈早期病变进行及时跟踪及辅助诊断：了解病毒扩增、基因亚型、病毒载量及病毒基因组通过自我组装整合到宿主细胞，诱导E6、E7基因表达癌蛋白，阻止细胞凋亡，致细胞周期失控，从而作为细胞发生高级别病变的重要信号[6]。而细胞DNA倍体分析作为新发展的细胞学检测方法主要从细胞水平对宫颈早期病变进行判断，通过结合细胞形态改变及细胞核内DNA含量或倍体的测定来判断细胞的生理状态和病理改变[7]。

本文研究结果提示，尽管高危型HPV DNA核酸检测可获得相对较高的灵敏度（90.77%），但其特异度仅为16.92%，易对患者造成不必要的心理压力，甚至误治或行阴道镜病理检查，也无法对宫颈病变程度进行监测，造成漏诊。单独的细胞学检测具有较高的灵敏度（79.49%）和特异度（86.15%），但因取材、制片及病理医师的诊断水平高低因素，也常伴有假阴性，造成误诊。而两种方法联合筛查弥补了各自单独检测时的缺点，同时从细胞和分子水平对HPV感染后细胞的一系列变化进行跟踪判断，通过显著提高特异度（92.31%，分别高于41.54%和86.15%）和准确度（86.15%），减少了误诊、漏诊事件的发生，也有助于改进宫颈癌筛查工作质量[8]。

宫颈癌是目前唯一一个病因明确并且可以预防的癌症，它的发生是一个渐进的过程，包含多个阶段，由HPV感染至CIN，再到宫颈癌的演变过程长达数十年，在此期间进行准确的筛查及诊治具有重要意义，尤其对于宫颈上皮高级别病变患者。目前，宫颈癌的筛查工作仍面临一定挑战，每年仍有不少新确诊的宫颈癌患者，且呈年轻化与地区增长性趋势，尤其是经济欠发达地区，多存在人口基数大、医疗卫生资源短缺、病理医生不足、经费较少等问题[9]。细胞学检测的发展大大降低了宫颈癌的死亡率，但受上述问题影响，加之宫颈细胞学检测对医生主观判断宫颈细胞异常状态的依赖性较强，同时细胞核发生异常时病情多已进展至中晚期，不利于早期诊断宫颈病变[10-11]。

HPV持续感染是导致颈癌变的重要原因，因此HPV DNA分型检测必然在宫颈癌筛查中的占据重要地位，在早期宫颈病变的筛查及分流诊治中具有关键性作用。细胞DNA倍体分析对高危HPV的检出率高，其检测图像系统对异常细胞有较高的敏感性，可以及时发现细胞核中DNA含量和结构发生异常的变化，进而发现DNA异倍体细胞，可以是肿瘤预测和预后评估的一项重要检测方法，为患者的进一步分流诊治提供重要的检测依据[12]。因此，本文在高危HPV DNA核酸检测的基础上联合细胞DNA倍体分析进行研究，结果提示，两种方式联合检测显著提高了宫颈病变筛查的灵敏度、特异度及准确度，减少漏诊、误诊的发生，有利于高危HPV感染妇女的分流诊治，及时发现早期的宫颈病变，避免宫颈上皮高级别病变漏诊，对于阻断病情发展，预防宫颈癌，具有较高的临床应用价值。

参考文献

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（收稿日期：2017-07-25）

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