QuEChERS法与UPLC—MS/MS法测定水稻糙米中的吡唑醚菌酯残留

摘要：采用QuEChERS的前处理方法，建立了一种简单、快速、灵敏的水稻糙米中吡唑醚菌酯残留量的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析方法。该方法以乙腈作为萃取溶剂，经液液分配萃取后，盐析分层，N-丙基-乙二胺键合硅胶（PSA）和C18键合硅胶净化后，进行超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析，实现了样品的快速提取、净化、分离和检测。在优化条件下，吡唑醚菌酯在0.01～0.5 mg/L的范围内浓度与峰面积呈良好线性关系（R2=0.990 0），回收率为82%～106%，相对标准偏差小于11%，该方法具有较好的准确度和精密度。经水稻田间试验，发现糙米中的吡唑醚菌酯残留量在0.006～0.023 mg/kg之间。

关键词：吡唑醚菌酯；QuEChERS；超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）；糙米；最终残留

中图分类号：O658 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）24-6366-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.070

Abstract：In this paper，a high efficient，rapid and sensitive determination method of pyraclostrobine in brown rice samples was proposed by a modified QuEChERS （quick，easy，cheap，effective，rugged and safe） method. Acetonitrile （ACN） was used to extract the residue of pyraclostrobine in samples.After salting out，the organic layer was cleaned up using PSA and C18 sorbents，and then the solution was directly analyzed by ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS），resulting in rapid extraction，clean-up，separation and detection of pyraclostrobine in samples. Under the optimized LC and MS conditions，good linearity in the range of 0.01～0.05 mg/kg was obtained for pyraclostrobine with R2 of 0.990 0.The method recoveries of the pyraclostrobine spiked at low，middle and high concentrations in blank rice samples were from 82% to 106%，with relative standard deviations less than 11%，indicating that the proposed method has good accuracy and precision.At last，the proposed method was applied to analyze the final residues of pyraclostrobine in samples，and the residues of pyraclostrobine in brown rice samples were in the range of 0.006～0.023 mg/kg.

Key words：pyraclostrobine；QuEChERS；utra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry； brown rice；final residues

吡唑醚菌酯又名唑菌胺酯、百克敏，是一种含有吡唑结构的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂[1]，可以防治由多种真菌病原引起的病害，例如谷类作物的白粉病、锈病、叶枯病等[2，3]。目前，吡唑醚菌酯在农业生产中应用较为广泛，其在作物中的残留不可避免，因此开展作物中吡唑醚菌酯残留的检测方法研究很有必要。吴洁珊等[4]采用气相色谱测定柑橘中多种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的残留量；薄海波等[5]采用气相色谱-质谱法测定食品中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留；徐英江等[6]采用液相色谱串联质谱测定蔬菜中残留的吡唑醚菌酯。传统的紫外或荧光检测器在低残留水平下抗干扰能力差，常常出现假阳性结果，而质谱检测器具有灵敏度高、选择性好等特点，可以实现复杂样品中农药残留的高灵敏度定性和定量分析，因此近年来在农药残留分析中应用非常广泛。

2003年Anastassiades等[7]提出一种QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）方法，该方法用于水果和蔬菜样品中的农药残留分析，具有快速、简单、廉价、有效、稳定和安全等特点。QuEChERS方法采用乙腈作为最初的提取溶剂，加无机盐后通过盐析作用实现了有机相和水相的完全分离，避免了非极性溶剂的液液分配萃取步骤。一部分的提取液通过分散固相萃取（dSPE）净化，离心除去吸附剂后浓缩定容或直接进行下一步分析。目前研究表明，N-丙基-乙二胺键合硅胶（PSA）吸附剂具有弱的阴离子交换能力，有利于吸附样品基质中的有机酸、糖以及色素，在蔬菜的农药残留分析中应用非常广泛[8，9]。同时，C18用于去除稻米提取液中的脂类物质效果较好。因此，在本研究中，将PSA和C18作为QuEChERS方法的吸附剂，结合超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的分离检测，建立了一种水稻糙米中吡唑醚菌酯残留量的检测方法。该方法简单、快速、灵敏度高，符合农药残留检测的要求，为开展水稻中农药吡唑醚菌酯的残留试验提供了有效的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水稻样品取自农药残留田间试验的样品，采用四分法取样。稻穗经脱粒，去壳分离得到糙米，粉碎后置于-18 ℃保存，待测。吡唑醚菌酯标样购自上海农药研究所，N-丙基-乙二胺键合硅胶（PSA）和C18键合硅胶购自博纳艾杰尔公司，色谱纯的甲醇、乙腈、甲酸购自美国Tedia公司，其他试剂均为分析纯，去离子水由Milli-Q纯水仪（Millipore， USA）制备。

1.2 主要仪器

ACQUITYTM超高效液相色谱仪-XevoTMTQ-S三重四级杆串联质谱仪（Waters，美国）；SK8200LH超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；Anke TDL-40B型离心机（上海安亭仪器厂）；IKA MS1 Minishake漩涡振荡器（IKA，德国）；BSA2202S电子天平（Sartorius，德国）；Milli-Q纯水仪（Millipore，美国）。

1.3 方法

1.3.1 色谱分析 色谱柱：ACQUITY UPLC@BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）（Waters，Belgium）；流动相：甲醇/0.1%甲酸（30/70，V/V），流速为0.25 mL/min；柱温：40 °C；进样量：10 μL。

1.3.2 质谱分析 ESI正离子模式，离子源温度150 ℃，脱溶剂气温度500 ℃，脱溶剂气流量1 000 L/Hr，毛细管电压3.0 kV，在多反应监测（MRM）下采集数据。首先采用流动注射的方式将目标物标准溶液直接注入质谱仪中，在m/z 50～500内全扫描，得到一级质谱图的准分子离子峰[M+H]+作为前体离子；然后进行二级质谱扫描，对锥孔电压和碰撞能量优化，选择丰度较高的两个碎片离子作为定量和定性离子对。具体参数如表1所示。

1.3.3 样品前处理

称取已粉碎的糙米样品5.0 g于100 mL离心管中，添加5.0 g无水硫酸钠，涡旋混合，加入15 mL乙腈，高速匀浆2 min，振荡器上振荡30 min后，于3 500 r/min下离心5 min，待净化。准确吸取上层乙腈提取液1.5 mL于预先已加入150 mg无水MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18的离心管中，涡旋30 s，离心，取上层清液，过0.45 μm滤膜，待检测。

2 结果与分析

2.1 液相色谱条件和质谱条件的优化

吡唑醚菌酯分子结构中含有氮杂环，在ESI源的正离子模式下容易形成[M+H]+母离子。同时，相比于传统的高效液相色谱（HPLC），UPLC具有更短的分离时间和更高的分离效率。因此，本研究选择UPLC-ESI-MS/MS检测样品中的吡唑醚菌酯，与此同时，在水相中加入0.1%甲酸可显著提高分析物的离子化效率，有效地提高目标分析物的灵敏度。图1为吡唑醚菌酯的典型MRM谱图。

2.2 前处理条件的优化

由于稻米的基质成分复杂，含有大量的淀粉、脂类物质和蛋白质，因此有必要对QuEChERS提取液进行进一步的净化。PSA可吸附脂肪酸和一些糖类物质，而C18可除去提取液中非极性的脂类物质。本研究采用PSA和C18净化提取液，结果发现1.5 mL提取液中加入50 mg的PSA和50 mg的C18可以较好地除去基质对分离检测的干扰，同时可以获得令人满意的萃取回收率。

2.3 基质效应

在复杂样品的分析中，基质效应会严重影响UPLC-MS/MS定量分析的结果。因而在建立UPLC-MS/MS检测方法时应考虑基质效应的影响，并采取措施进行消除，从而保证检测结果的准确可靠。基质效应是指由于共洗脱杂质分子的干扰而导致目标分析物信号的增强或减弱，从而使分析结果不可靠，分析灵敏度降低等问题[9]。在本研究中，通过比较分析物在溶剂和2种基质中响应的比值来考察基质效应，结果表明分析物在2种基质和溶剂中的响应基本一致，表明基质效应很弱。弱的基质效应表明该法的净化效果较好，可以除去大部分的干扰物质，减弱了基质效应。因此，本研究采用溶剂校准曲线来分析稻米中的吡唑醚菌酯残留量。

2.4 线性范围和检出限

称取0.025 g吡唑醚菌酯标准品于25 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容，得到1 000 mg/L的标准储备液，再依次将其稀释成0.50、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 mg/L的标准工作液，取以上标准工作液各1 μL进样检测，以峰面积对质量浓度进行线性回归。吡唑醚菌酯的回归方程为y=5 893x+ 16 162，R2为0.990 0。以3倍信噪比计算最低检测量，吡唑醚菌酯的最低检测浓度为0.005 mg/kg。结果表明分析物在0.01～0.5 mg/L浓度范围内呈较好线性关系，同时方法灵敏度较高，可满足实际样品检测要求。

2.5 回收率、精密度和最小检测浓度

在未施用农药吡唑醚菌酯的稻田采集空白水稻糙米样品，分别进行3个水平的加标回收率试验，结果见表1。从表2可见，稻米中吡唑醚菌酯在低、中、高3种添加浓度的加标回收率为106%，96%和82%，相对标准偏差（RSD）分别为5.2%，3.5%和11.0%，表明方法具有很好的准确度和精密度，可以满足实际样品分析检测的要求。

2.6 样品分析

吡唑醚菌酯悬浮剂以100 g.ai/hm2分别施药2和3次，距最后一次施药间隔21 d和28 d，采集水稻的稻穗样品，经脱壳后分离得到糙米样品，糙米中的吡唑醚菌酯残留按上述方法提取、净化及检测，结果见表3。糙米中的残留量在0.006～0.023 mg/kg，残留量较低，表明农药按照这个剂量和采收期施药对人体健康的威胁较小。

3 小结

QuEChERS法具有快速、简单、廉价、有效、稳定和安全等特点，是目前各种食品样品中农药残留分析最常用的分析方法。本研究采用QuEChERS方法处理土壤样品，结合UPLC-MS/MS分离检测，建立了一种糙米中吡唑醚菌酯的快速、高效、灵敏的分析方法。对所建立的方法进行了考察，包括基质效应、线性、检出限、回收率和精密度等，结果表明该方法符合农药残留分析的要求，可作为农药残留试验和日常检测糙米样品中吡唑醚菌酯的检测方法。

参考文献：

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[3] BARTLETT D W，CLOUGH J M，GODWIN J R，et al. Review： the strobilurin fungicides[J]. Pest Manag Sci，2002，58（7）：649-662.

[4] 吴洁珊，冯家望，任永霞，等.气相色谱测定柑橘中多种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的残留量[J].农药，2011，50（10）：754-755.

[5] 薄海波，王金花，郭春海，等.气相色谱/串联质谱法测定食品中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留[J].分析化学研究报告，2008， 36（11）：1471-1475.

[6] 徐英江，耿金培，张秀珍，等.液相色谱串联质谱测定蔬菜中残留的唑菌胺酯[J].湖北农业科学，2009，21（12）：1704-1707.

[7] ANASTASSIADES M，LEHOTAY S J，STAJNBAHER D，et al. Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and "dispersive solid-phase extraction" for the determination of pesticide residues in produce[J]. J AOAC Int， 2003， 86（2）： 412-431.

[7] 李胜清，田 华，柳训才，等.固相萃取-气相色谱法用于蔬菜中拟除虫菊酯类农药残留的检测研究[J].分析科学学报，2005， 21（3）：289-291.

[8] 刘晓松，童张法，郑 玲，等.固相萃取-高效液相色谱法同时测定噻菌灵和多菌灵在浓缩菠萝汁中的残留量[J].分析科学学报， 2007，23（3）：311-314.

[9] GILBERT-LOPEZ B，GARCIA-REYES J F，LOZANO A，et al. Large-scale pesticide testing in olives by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry using two sample preparation methods based on matrix solid-phase dispersion and QuEChERS[J]. J Chromatogr A，2010，1217（39）：6022-6035.

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