溴虫氟苯双酰胺对小菜蛾的毒力及相关酶活性的影响
时间：2022-03-29 10:35:14 浏览次数：次
摘要
溴虫氟苯双酰胺是一种全新的双酰胺类杀虫剂，主要用于防治鳞翅目、鞘翅目、白蚁以及蚊蝇等害虫。为了明确溴虫氟苯双酰胺对小菜蛾的生物活性及解毒酶活性的影响，本研究选择氯虫苯甲酰胺为对照药剂，采用叶片药膜法测定了溴虫氟苯双酰胺对小菜蛾的生物活性，并测定了亚致死剂量（LC20、LC40）的溴虫氟苯双酰胺和氯虫苯甲酰胺对小菜蛾多功能氧化酶、谷胱甘肽S转移酶和羧酸酯酶活性的影响。结果表明，溴虫氟苯双酰胺与氯虫苯甲酰胺对小菜蛾的生物活性相当，两者对小菜蛾的LC50分别为0.042和0.056 μg/mL。与氯虫苯甲酰胺相似，亚致死剂量的溴虫氟苯双酰胺能够诱导小菜蛾体内羧酸酯酶活性升高，但溴虫氟苯双酰胺对多功能氧化酶和谷胱甘肽S转移酶活性没有显著影响。
关键词
溴虫氟苯双酰胺；小菜蛾；毒力；酶活性
中图分类号：
S 481.1
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.01.018
Abstract
Broflanilide is a new diamide insecticide. It is mainly used for the control of lepidopteran and coleopteran pests as well as termites， mosquitoes， houseflies and so on. In order to determine the insecticidal activity and the effects of broflanilide on the activity of related enzymes in Plutella xylostella， chlorantraniliprole was chosen as the control agent and leafdip method was used. The effect of sublethal concentrations （LC20 and LC40） of broflanilide and chlorantraniliprole on multifunctional oxidase （MFO）， glutathione Stransferase （GSTs） and carboxylesterase （CarE） were investigated. The results showed that broflanilide had high insecticidal activity against P.xylostella. The LC50 value of broflanilide was 0.042 μg/mL， while that of chlorantraniliprole was 0.056 μg/mL. The treatment of LC20and LC40of broflanilide increased the activity of CarE， but had no significant effects on GSTs and MFO.
Key words
chlorantraniliprole；diamondback moth；toxicity；activity of enzyme
小菜蛾Plutella xylostella Linnaeus属于鳞翅目菜蛾科，是一种对十字花科芸薹属作物危害最严重的世界性害虫[1]。小菜蛾主要通过幼虫取食造成作物的减产甚至绝收。每年由小菜蛾造成的直接经济损失以及用于防治小菜蛾的费用已经由20世纪90年代的10亿美元[2]上升到如今的40～50亿美元[3]。热带及亚热带单一寄主植物连续种植的地区，小菜蛾一年最多可发生18～20代，高强度的杀虫剂作为一种抗性选择压使小菜蛾在2～3年时间便会对一种新型杀虫剂产生抗药性[4]。根据2014年节肢动物杀虫剂抗药性数据库（）的数据显示，小菜蛾已经对几乎所有类型的用于防治其危害的杀虫剂产生了抗药性，包括有机磷类、有机氯类、氨基甲酸酯类、除虫菊酯类、昆虫生长调节剂类以及微生物制剂（如苏云金芽胞杆菌）[5]。
氯虫苯甲酰胺（chlorantraniliprole）是美国杜邦公司开发的高效、安全的双酰胺类杀虫剂，其作用方式新颖：通过与鱼尼丁受体结合，激活钙离子通道，引起细胞内钙库中的钙离子过度释放，使肌肉细胞丧失收缩功能[6]，从而使害虫迅速停止进食，出现乏力、反胃和肌肉瘫痪的症状，直至死亡[78]。氯虫苯甲酰胺对几乎所有的鳞翅目害虫，部分鞘翅目、双翅目和半翅目害虫都有良好的防治效果[9]。氯虫苯甲酰胺被广泛用于小菜蛾的防治，但是短短几年时间，在我国华南地区，以及菲律宾、泰国和巴西均已发现对氯虫苯甲酸胺产生高水平抗性的小菜蛾田间种群。据报道，我国广东地区的小菜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性已经达到2 140倍[10]。
溴虫氟苯双酰胺（broflanilide）是由日本三井农业化学公司和巴斯夫共同合作开发的新型双酰胺类杀虫剂，其化学结构如图1所示。溴虫氟苯双酰胺主要用于防除绿叶蔬菜、多年生作物和谷物等作物上的鳞翅目、鞘翅目、白蚁以及蚊蝇等害虫。目前还没有该药剂对小菜蛾的毒力报道，其作用机制也还未明确[11]。
本研究以氯虫苯甲酰胺为对照药剂，比较了溴虫氟苯双酰胺和氯虫苯甲酰胺兩种药剂对小菜蛾的毒力以及相关酶活性的影响，以期为溴虫氟苯双酰胺的推广应用及其对小菜蛾的生化作用机理等研究提供依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1供试药剂
99.59%溴虫氟苯双酰胺（broflanilide， MCI8007）原药，日本三井农业化学公司；98%氯虫苯甲酰胺（chlorantraniliprole）原药，美国杜邦公司。
1.1.2化学试剂
乙二胺四乙酸（EDTA）、苯甲基磺酰氟（PMSF），Amresco公司；二硫代苏糖醇（DTT）、还原性谷胱甘肽（GSH），Merck公司；苯基硫脲（PTU），Aladdin；对硝基苯甲醚（PNA）、1氯2，4二硝基苯（CDNB），Aldrich公司；还原型辅酶Ⅱ（NADPHⅡ），Biotopped；考马斯亮蓝G250，Fisher Scientific；β醋酸萘酯（2naphthyl acetate）、固蓝B盐（fast blue B），Sigma；十二烷基硫酸钠（SDS），华美生物工程公司；牛血清蛋白（BSA），中国科学院东方仪器设备公司；毒扁豆碱（eserine），东京化成工业株式会社；磷酸、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、甘油，国药集团化学试剂有限公司；丙酮、乙醇，北京化工厂。
1.1.3主要仪器
116K微型离心机（美国Sigma公司）；96孔酶标板（美国Corning公司）；ELx800光吸收酶标仪（美国BioTek公司）；ISRDD3台式恒温振荡器（美国精骐有限公司）。
1.1.4供试虫源
小菜蛾为室内逐代饲养的种群，不接触任何药剂，饲养方法参照杨峰山等[12]的方法，饲养及生测试验条件：温度（27±1）℃，湿度80%～90%，光周期L∥D=14 h∥10 h。
1.2试验方法
1.2.1毒力测定
采用杀虫剂抗性行动委员会（IRAC）推荐的叶片药膜法[13]，分别测定氯虫苯甲酰胺和溴虫氟苯双酰胺对小菜蛾的毒力。将原药溶于二甲基甲酰胺（DMF）中，分别配制成1%的氯虫苯甲酰胺和溴虫氟苯双酰胺母液。在预试验的基础上，将母液用0.05%的曲拉通X100稀释，配制5～7个系列药剂浓度。将油菜叶片洗净晾干，在药液中浸渍10 s，取出晾干放入直径9 cm、底部垫有吸水滤纸的培养皿中，接入大小一致的3龄初幼虫。每处理3次重复，每重复10头试虫。72 h后检查死亡虫数，计算各处理的校正死亡率。以解剖针轻触虫体，不能正常反应视为死亡。
1.2.2酶活力测定
1.2.2.1亚致死浓度处理
根据毒力测定结果，以各个药剂72 h的LC20、LC40值作为亚致死剂量，以0.05%曲拉通X100作为对照。取新鲜无农药污染的油菜叶片，分别在0.05%曲拉通溶液和药剂亚致死剂量药液中浸渍10 s，取出晾干后放入直径9 cm、底部垫有吸水滤纸的培养皿中，接入大小一致的3龄初幼虫，饲喂72 h，计算各药剂亚致死浓度下的校正死亡率。分别取不同处理后存活的幼虫进行相关酶活性的测定。
1.2.2.2酶液制备
取小菜蛾10头（13～16 mg）加入2 mL pH 7.8、0.1 mol/L的PBS缓冲液（含1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、1 mmol/L PTU、1 mmol/L PMSF和质量分数为10%的甘油）冰浴中整体研磨匀浆，匀浆液12 000 r/min、4℃离心15 min，上清液作为酶源。酶源作为多功能氧化酶（MFO）和谷胱甘肽S转移酶（GSTs）活性测定的酶液，将酶源用pH 7.0、0.04 mol/L的PBS缓冲液稀释10倍作为羧酸酯酶（CarE）活性测定的酶液。每处理设6次生物学重复。
1.2.2.3多功能氧化酶O脫甲基活性测定
参考Yang等[14]的方法并略有改动。在96孔板中依次加入100 μL 2 mmol/L的PNA，90 μL酶液和10 μL 9.6 mmol/L的NADPHⅡ。立即放入酶标仪，在405 nm下连续测定30 min内吸光度的变化。每个样品设5次技术重复。
1.2.2.4谷胱甘肽S转移酶（GSTs）活性测定
参考Oppenoorth等[15]的方法。在2 mL离心管中依次加入1.2 mL pH 7.4、66 mmol/L的PBS缓冲液（含2 mmol/L EDTA），0.15 mL 50 mmol/L的GSH， 0.05 mL 0.03 mol/L的CDNB和0.1 mL酶液，空白对照中加入1.3 mL pH 7.4、66 mmol/L的PBS缓冲液（含2 mmol/L EDTA）。在340 nm下连续测定5 min内吸光度的变化。每个样品设3次技术重复。
1.2.2.5羧酸酯酶（CarE）活性测定
参照van Asperen等[16]的方法，略有改动。每个待测酶液设置4个浓度，在2 mL离心管中分别加入0、0.028 5、0.057和0.085 5 mL酶液，以及相应的pH 7.0、0.04 mol/L的PBS缓冲液0.285、0.256 5、0.228和0.2 mL，然后在每个离心管中加入1.43 mL 3×10-4 mol/L底物（含1×10-6mol/L的毒扁豆碱），混匀后置于30℃的摇床上反应30 min，最后加入0.285 mL显色液（现配现用），摇匀后静置30 min，用酶标仪测定600 nm下的吸光度。每个样品设3次技术重复。
1.2.2.6总蛋白含量测定
采用Bradfold等的考马斯亮蓝（G250）[18]方法测定。
1.3数据统计分析与处理
采用DPS 7.05软件计算毒力回归方程和致死中浓度，酶活力测定结果用SPSS软件进行方差分析。
2结果与分析
2.1氯虫苯甲酰胺和溴虫氟苯双酰胺对小菜蛾毒力
由表1可知，氯虫苯甲酰胺和溴虫氟苯双酰胺对小菜蛾均有较高的毒力指数，两种药剂的LC50分别为0.056 μg/mL和0.042 μg/mL，都表现了良好的杀虫活性，两药剂对小菜蛾的毒力没有显著差异。
氯虫苯甲酰胺对小菜蛾的LC20和LC40分别为0.021 μg/mL和0.041 μg/mL，溴虫氟苯双酰胺对小菜蛾的LC20和LC40分别为0.020 μg/mL和0.034 μg/mL，分别以各药剂LC20和LC40作为亚致死剂量处理3龄初小菜蛾幼虫用于相关酶活性的测定。
经过反向验证，即配制0.021 μg/mL和0.041 μg/mL的氯虫苯甲酰胺溶液，处理小菜蛾3龄初幼虫72 h后的校正死亡率分别为20.45%和40.27%；配制0.020 μg/mL和0.034 μg/mL的溴虫氟苯双酰胺溶液，处理小菜蛾3龄初幼虫72 h后的校正死亡率分别为19.39%和40.82%，其死亡率分别接近20%和40%，因此以这几个浓度分别作为两种药剂的LC20和LC40是合理的。
2.2 氯虫苯甲酰胺和溴虫氟苯双酰胺对小菜蛾体内相关酶活性的影响
经氯虫苯甲酰胺和溴虫氟苯双酰胺不同浓度处理72 h后，小菜蛾体内多功能氧化酶活力如图2所示。与对照相比，溴虫氟苯双酰胺LC20和LC40处理对多功能氧化酶没有显著影响；而氯虫苯甲酰胺LC20和LC40处理后对多功能氧化酶表现出明显的抑制作用，抑制率分别为28.86%和38.30%，两浓度对小菜蛾多功能氧化酶活性影响没有显著差异。与对照相比，氯虫苯甲酰胺和溴虫氟苯双酰胺不同处理对谷胱甘肽S转移酶活性均没有显著影响（图3）。两种药剂不同处理对小菜蛾羧酸酯酶均有显著的诱导作用。与对照相比，羧酸酯酶活力分别升高了26.77%、24.51%、27.29%和31.06%，各处理之间没有明显差异（图4）。
两种药剂相比，氯虫苯甲酰胺亚致死剂量处理对多功能氧化酶表现出抑制作用，两浓度之间差异不显著，但溴虫氟苯双酰胺对多功能氧化酶没有显著影响。对羧酸酯酶的影响，两种药剂都有显著的促进作用，且两种药剂不同处理之间无显著差异。
3讨论
田间施用杀虫剂后，害虫大部分时间会处在药剂的亚致死剂量环境下，杀虫剂的亚致死效应提供了持续的选择压力，加快了害虫抗药性的产生[19]。近年来，药剂的不合理施用使得害虫抗药性问题越来越突出。
氯虫苯甲酰胺2008年在中国上市，由于其作用位点单一，若长期广泛使用，有较高的抗性风险[9]。据报道，2010年广东省田间小菜蛾就对氯虫苯甲酰胺产生了抗性[20]，2012年监测数据显示，广东增城地区小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性已达2 140倍[10]。溴虫氟苯双酰胺作为一种全新的还未投入市场的双酰胺类杀虫剂，在室内试验中对小菜蛾表现出了和氯虫苯甲酰胺相当的优异的杀虫活性。但由于其杀虫机理尚未明确，害虫对其产生抗性的风险还不清楚。另外，溴虫氟苯双酰胺是否与氯虫苯甲酰胺存在交互抗性也需要在以后的试验中进行探索。
昆虫通过提高其体内解毒酶活性将进入其体内的有毒化合物氧化、还原、水解或结合，以增强其水溶性，将其转变成低毒或无毒的物质，使之排出体外，从而达到解毒的目的[21]。昆虫体内的解毒酶主要包括多功能氧化酶（MFO）、羧酸酯酶（CarE）和谷胱甘肽S转移酶等[2223]。MFO是杀虫剂解毒代谢的最重要的酶系之一，对包括拟除虫菊酯、氨基甲酸酯、有机磷等在内的多种杀虫剂都有不同水平的解毒代谢作用[24]。酯酶在昆虫对氨基甲酸酯类和有机磷类杀虫剂产生抗性中具有重要作用[25]。谷胱甘肽S转移酶与小菜蛾对有机磷类、阿维菌素、拟除虫菊酯类和Bt的抗性有关[26]。邢静等研究发现，经亚致死浓度的氯虫苯甲酰胺短期处理（72 h）后，对小菜蛾CarE 活性具有明顯的诱导作用，但对GSTs和MFO的活性则均表现出明显的抑制作用[9]；Cao等的研究表明：经0.1 μg/mL的氯虫苯甲酰胺处理可诱导棉铃虫敏感品系酯酶和GSTs活性升高[27]；Sial等的研究表明，酯酶活性升高是稻纵卷叶螟对氯虫苯甲酰胺产生低倍抗性的主要原因[28]。
本研究从昆虫对溴虫氟苯双酰胺和氯虫苯甲酰胺的解毒代谢机制出发，比较了两种药剂亚致死剂量对小菜蛾体内3种解毒酶活性的影响。结果表明，溴虫氟苯双酰胺和氯虫苯甲酰胺两种药剂亚致死剂量均能引起小菜蛾体内的生理代谢反应。其中两药剂亚致死剂量处理均能诱导羧酸酯酶活性提高，但对谷胱甘肽S转移酶没有影响。两者对多功能氧化酶的影响不同，氯虫苯甲酰胺亚致死剂量处理显著抑制了多功能氧化酶的活力，而溴虫氟苯双酰胺对多功能氧化酶活力无明显影响。因此羧酸酯酶可能参与了对两种药剂的解毒代谢作用，这与邢静等[9]和Sial等[28]的研究结果一致。
本研究中对小菜蛾体内解毒酶活性的测定均是在两种药剂短期胁迫下进行的，要明确某种解毒酶是否确实参与了小菜蛾对溴虫氟苯双酰胺的代谢还需要进一步的系统研究。本研究结果对于溴虫氟苯双酰胺合理使用、减少其不良副作用及延缓其抗药性的产生具有一定的指导作用。
参考文献
[1]郭磊. 小菜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性的分子机制[D]. 北京： 中国农业大学， 2014.
[2]Talekar N S， Shelton A M.Biology， ecology， and management of the diamondback moth [J]. Annual Review of Entomology， 1993， 38： 275301.
[3]Zalucki M P， Shabbir A， Silva R， et al. Estimating the economic cost of one of the world’s major insect pests， Plutella xylostella （Lepidoptera： Plutellidae）： just how long is a piece of string？[J]. Journal of Economic Entomology， 2012， 105（4）： 11151129.
[4]Furlong M J， Wright D J， Dosdall L M.Diamondback moth ecology and management： problems， progress， and prospects[J]. Annual Review of Entomology， 2013， 58： 517544.
[5]节肢动物杀虫剂抗药性数据库[DB/OL]. .
[6]唐振华， 陶黎明. 新型二酰胺类杀虫剂对鱼尼丁受体作用的分子机理[J]. 昆虫学报， 2008， 51（6）： 646651.
[7]董卫莉， 徐俊英， 刘幸海， 等. 昆虫鱼尼丁受体及以其为靶标的杀虫剂的研究进展[J]. 农药学学报， 2008， 10（2）： 178185.
[8]Ohkawa H， Miyagawa H， Lee P W.Pesticide chemistry： crop protection， public health， environmental safety[M]. Weinheim： WileyVCH WileyVCH Verlag GmbH & Co. KGaA， Germany， 2007： 137140.
[9]邢静， 梁沛， 高希武. 亚致死浓度氯虫苯甲酰胺对小菜蛾药剂敏感度和解毒酶活性的影响[J]. 农药学学报， 2011， 13（5）： 464470.
[10]王海慧， 章金明， 吕要斌. 小菜蛾氯虫苯曱酰胺抗性快速形成的生物学机制[C]∥病虫害绿色防控与农产品质量安全——中国植物保护学会2015年学术年会论文集， 2015： 508509.
[11]杨吉春， 吴峤， 王秀丽. 2014 年公开的新农药品种[J]. 农药， 2015， 54（3）： 215216.
[12]杨峰山， 张友军， 张文吉， 等. 用甘蓝苗连续饲养小菜蛾的技术[J]. 昆虫知识， 2004， 41（5）： 483486.
[13]IRAC.Proposed insecticide/ acaricide susceptibility tests developed by insecticide resistance action committee[R]. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin， 1990， 20： 389400.
[14]Yang Y， Wu Y， Chen S， et al. The involvement of microsomal oxidases in pyrethroid resistance in Helicoverpa armigera from Asia [J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2004， 34（8）： 763773.
[15]Oppenoorth F J， van der Pas L J T， Houx N W H.Glutathione Stransferase and hydrolytic activity in a tetrachlorvinphosresistant strain of housefly and their influence on resistance [J]. Pesticide Biochemistry and Physiology， 1979， 11（1/3）： 176178.
[16]van Asperen K.A study of housefly esterases by means of a sensitive colormetric method [J]. Journal of Insect Physiology， 1962， 8 （4）： 401414.
[17]Gorun V， Proinov I， Baltescu V， et al. Modified Ellman procedure for assay of cholinesterases in crude enzymatic preparations [J]. Analytical Biochemistry， 1978， 86（1）： 324326.
[18]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J]. Analytical Biochemistry， 1976， 72（12）： 248254.
[19]尹飛， 冯夏， 李振宇， 等. 亚致死剂量氯虫苯甲酰胺对小菜蛾体内活性酶的影响[J]. 植物保护， 2014， 40（2）： 6669.
[20]胡珍娣， 冯夏， 李振宇， 等. 不同小菜蛾田间种群对氯虫苯甲酰胺药剂的敏感性[J]. 农药研究与应用， 2010， 14（3）： 2527.
[21]张靖， 曹雅琴， 崔丽， 等. N′硝基缩氨基胍类化合物对蚜虫的室内毒力测定及相关酶活性的影响[J]. 农药学学报， 2015， 17（2）： 143148.
[22]张文吉， 张友军， 韩熹莱. 棉铃虫不同龄期幼虫羧酸酯酶、谷胱甘肽转移酶、乙酰胆碱酯酶研究[J]. 植物保护学报， 1996， 23（2）： 157162.
[23]杨帅. 大豆蚜对吡虫啉的抗性监测及抗性机理研究[D]. 哈尔滨： 东北农业大学， 2012.
[24]牛芳. 小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的防御、代谢、及抗性风险评估[D]. 泰安： 山东农业大学， 2011.
[25]张柳平， 姚淑敏， 林哲， 等. 两个单点突变对昆虫羧酸酯酶降解马拉硫磷的影响[J]. 昆虫学报， 2013， 56（5）： 566569.
[26]夏耀民. 小菜蛾对茚虫威抗药性研究[D]. 武汉： 华中农业大学， 2014.
[27]Cao Guangchun， Lu Qiong， Zhang Lili， et al. Toxicity of chlorantraniliprole to Cry1 Acsusceptible and resistant strains of Helicoverpa armigera [J]. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2010， 98（1）： 99103.
[28]Sial A A， Brunner J F， Garczynski S F.Biochemical characterization of chlorantraniliprole and spinetoram resistance in laboratoryselected obliquebanded leafroller， Choristoneura rosaceana （Harris） （Lepidoptera： Tortricidae）[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2011， 99（3）： 209284.
（责任编辑：田喆）