黄芪对体外培养心肌细胞保护作用的实验研究

[摘要] 目的：观察黄芪对体外培养的缺糖缺氧损伤心肌细胞的保护作用。方法：心肌细胞原代单层培养，观察心肌细胞形态学变化、细胞生化数据的改变以及超微结构形态学的变化。结果：药物组与药物对照组的心肌细胞内上述细胞损伤变化均得到明显恢复。结论：黄芪对体外培养的缺糖缺氧心肌细胞具有明显的保护作用。

[关键词] 黄芪；乳鼠心肌细胞；组织化学；生化检测；透射电镜

[中图分类号] R282.71[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）12（b）-011-03

Experimental study of Astragalus on protective effect of in vitro cultured myocardial cells

LI Hong-zhe1 ,JIN Xiang-zi2

(1.Yanbian Tumour Hospital, Yanji133000, China; 2.Yanbian University College of Medicine, Yanji133000, China)

[Abstract] Objective: To observe the protective effect of Astragalus on in vitro cultured myocardial cells suffering hypoxia-hypoglycemia-induced injury. Methods: Myocardial cells were performed by primary monolayer culture, then the morphological changes, biochemical data change and ultrastructural morphology change of the myocardial cells were observed. Results: The cell injury of the myocardial cells in drug group and control group of drugs significantly recovered. Conclusion: Astragalu shows a marked protective effect on in vitro cultured myocardial cells suffering hypoxia-hypoglycemia-induced injury.

[Key words] Astragalus; Rat myocardial cells; Histochemistry; Biochemistry detection; Transmission electron microscope

黄芪为豆科植物膜荚黄芪[Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge]、蒙古黄芪[Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge).Hsiao]的干燥根，又称北芪、元芪或黄耆。豆科，多年生草本。味甘，微温，具有补气固表、托疮生肌、利水的功效，主治气血虚弱、自汗、久泻脱肛、子宫脱垂、肾炎水肿、蛋白尿、糖尿病、慢性溃疡等症。近年来临床用来治疗高血压和急慢性肾炎。被历代医家认为是补药之长。近代研究表明，黄芪具有增强免疫功能、抗衰老等作用[1，2]。

本实验从细胞生物学水平探讨了黄芪水提物对培养乳鼠心肌细胞的保护作用及其作用机制，为开发黄芪提供科学实验及科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Wistar大白鼠乳鼠1～5日龄，雌、雄兼用，由延边大学医学部实验动物科提供；黄芪：由延边大学医学部植物化学教研室提供，用RPMI 1640培养基配成大剂量1 000 μg/ml，中剂量800 μg/ml，小剂量600 μg/ml，经过筛选，800 μg/ml为本实验适宜剂量浓度，过滤除菌，用于实验；人参皂苷：由延边大学医学部天然药物学教研室提取的白色粉末，纯度为85%，用RPMI 1640培养基配成300 μg/ml，过滤除菌，用于实验；RPMI 1640培养基：日本株式会社产品；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒：南京建成生物工程研究所提供；丙二醛(MDA)试剂盒：南京建成生物工程研究所提供；胶原酶：美国Sigma化学公司产品；胰蛋白酶：美国DIFCO公司产品；四氯化碳：北京化学试剂厂产品；小牛血清：长春生物制品厂产品；CO2培养箱：美国产；超净工作台：上海净化设备厂制造；德国 Leica820型组织切片机；日本Olympus VANOX型万能显微镜；722光栅分光光度仪：厦门分析仪器厂LKB2088型超薄切片机：瑞典JEM-1200 EX型透射电镜：日本产ZK 15低温高速离心机：Sigma产品；MK-3酶标仪：芬兰雷勃集团；TD-2000型真彩病理细胞显微分析系统：北京天地百年科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原代单层乳鼠心肌细胞培养方法乳鼠心肌细胞培养方法：采用姜玉顺等[3]的方法。取1～5日龄Wistar大白鼠乳鼠，在无菌条件下取心脏，0.06%胰蛋白酶进行冷消化，经过离心制成细胞悬液，接种后，原代单层培养至5～7 d用于实验。

1.2.2 实验分组取细胞生长良好的培养瓶40瓶，分为4组，即正常对照组：每隔3 d更换一次培养液；模型组：制备的缺糖缺氧损伤模型组；实验组：缺糖缺氧组内加入800 μg/ml黄芪；药物对照组：缺糖缺氧损伤模型组内加入0.5%人参总皂苷2滴(相当于生药0.5 mg)。

1.2.3 缺糖缺氧损伤模型的制备将生长良好的培养心肌细胞按上述分组以后，去掉培养液，放入自制缺氧盒中持续通入高纯氮气(99%)40 min，然后取高纯氮气饱和的培养基加入培养瓶中，同时向瓶内充氮气30 s，置换瓶内空气，在37℃恒温培养箱中密闭培养12 h后备用。

1.2.4 组织化学观察培养5～7 d，取生长良好的培养瓶40瓶分为4组。然后将各组在37℃恒温箱内继续培养60 min，取出生长盖玻片，显示琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、PAS法显示糖原等。酶组织化学反应按酶反应的着色深浅、颗粒的多少分为阴性、弱阳性、阳性、中等阳性、强阳性，用Olympus相差显微镜观察并摄片。

1.2.5 生化检测

1.2.5.1 培养液中LDH活性测定取生长良好的肝细胞培养瓶40瓶，分为正常对照组、模型组、实验组及药物对照组。将生长在培养瓶中的肝细胞用滴管吹打的方法取下来，1 000×g离心5 min，取上清液，按试剂盒说明测定各管吸光度。LDH活力=[(测定管-测定空白管)/(标准管-标准空白管)]×2 000(U/L)。

1.2.5.2 SOD活性及MDA含量测定轻轻吹打并刮脱生长在培养瓶壁的细胞，制成细胞悬液，用超声波粉碎机打碎细胞，每次10 s，4次，2 500×g离心15 min，取上清液，用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，用TAB法测定MDA含量。

1.2.6 电镜标本制备取生长良好的培养瓶分为正常对照组、模型组、实验组、实验对照组。先将培养的心肌细胞用0.1 mol/L磷酸缓冲液洗3次，2.5%戊二醛、1%锇酸分别固定30 min，取生长盖玻片以递增浓度的丙酮脱水，EPON定向包埋，37℃、45℃、60℃分别聚合12、24、36 h，用LKB 2088型切片机切成60 nm的超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅染色，JEM-1200 EX型透射电镜观察并摄片。

1.3 统计学方法

数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 11.5统计软件，利用方差分析及t检验进行数据分析处理。P＜0.05表示差异有统计学意义，P＜0.01表示差异有高度统计学意义。

2 结果

2.1 心肌细胞形态学观察

在倒置相差显微镜下观察各组心肌细胞。正常心肌细胞生长良好，心肌细胞数量多，细胞饱满，细胞突起较长，相邻细胞相互交织成簇生长，可见规律搏动。缺糖缺氧心肌细胞数量明显减少，细胞皱缩，细胞足突消失，细胞间耦联被破坏，出现微弱不规律的搏动。实验组与药物对照组和模型组比较，心肌细胞数量明显增多，细胞突起较长，可见相互交织成簇生长的心肌细胞团，搏动有规律且有力。

2.2 SOD活性及MDA含量的影响

实验组及药物对照组心肌细胞的SOD活性明显高于缺糖缺氧组(P＜0.01)，MDA含量明显低于缺糖缺氧组(P＜0.01)。

2.3 LDH活性的影响

模型组的培养液中LDH活性比正常对照组显著增高(P＜0.01)，而实验组与药物对照组的LDH活性均较模型组明显降低，差异有高度统计学意义(P＜0.01)。

2.4 黄芪对缺糖缺氧培养心肌细胞糖原含量的影响

用PAS法显示心肌细胞糖原，正常对照组心肌细胞胞质内充满深紫红色糖原颗粒，染色深，为强阳性。模型组心肌细胞胞质内几乎无糖原颗粒，染色浅，为弱阳性。实验组与药物对照组心肌细胞PAS反应均较模型组明显增强，胞质内糖原颗粒明显增多，染色深，呈强阳性。

2.5 黄芪对缺糖缺氧培养心肌细胞SDH活性的影响

正常对照组心肌细胞SDH活性为强阳性，染色深，蓝紫色沉淀颗粒分布均匀；模型组心肌细胞SDH活性明显减弱，为弱阳性，染色浅，蓝紫色沉淀颗粒明显减少；实验组与药物对照组心肌细胞SDH活性与模型组相比,其活性明显增强，呈强阳性，染色深，胞质内蓝紫色沉淀颗粒明显增多。

2.6 黄芪对缺糖缺氧培养心肌细胞LDH活性的影响

正常对照组心肌细胞 LDH活性为阳性，染色浅，胞质内棕黄色颗粒分布均匀。模型组心肌细胞 LDH活性明显增强，染色深，为强阳性，胞质内有大量棕黄色沉淀颗粒堆积。药物对照组及实验组心肌细胞ACP活性明显减弱，染色较浅，为阳性，胞质内棕黄色颗粒比模型组明显减少。

2.7 透射电镜观察

正常对照组心肌细胞，线粒体呈圆形或杆状，双层膜及嵴清楚可见，高尔基复合体可见，模型组心肌细胞质内，线粒体肿胀，嵴断裂，双层膜结构不清，高尔基复合体囊腔塌陷、变细。但是，实验组与药物对照组心肌细胞内上述变化均明显恢复，线粒体双层膜与内膜嵴清楚可见，高尔基复合体呈扁平囊状。

3 讨论

黄芪及其衍生物具有广泛的药理活性，临床上常用于防治脑溢血、高血压、视网膜出血、紫瘢、急性出血性肾炎、慢性气管炎、血管发脆、血管渗透压不正常等病症，同时还可预防和治疗糖尿病及合并高脂血症，对心、肾、脑等器官的缺血再灌注损伤具有保护作用，其治疗慢性支气管炎总有效率为84.4%。在食品工业中可作为抗氧化剂和天然食用黄色素[4,5]。SOD为直接清除自由基的酶，可阻断自由基促使产生LPO的链式反应，从而保护细胞不受自由基的损害。黄芪能增强SOD的活性，降低MDA含量，提高清除自由基的能力，减缓培养心肌细胞受自由基的攻击。而本实验用生化检测的方法检测出的SOD活性及MDA含量说明，黄芪可提高心肌细胞SOD的活性，清除自由基，并抑制脂质过氧化作用，保护心肌细胞免受缺氧损害[6,7]。

由本实验结果可见，黄芪能促进糖原合成，抑制糖酵解，从而减少糖原分解。它能抑制心肌细胞的糖酵解，减少糖原分解，促进糖原合成，并且纠正糖酵解过剩导致的细胞内酸中毒，阻碍细胞膜和膜性结构的过氧化作用，使损伤的心肌细胞也能在一定程度上纠正缺氧心肌细胞糖酵解过盛造成的细胞内酸中毒。

黄芪中的黄酮类能使受损的心肌细胞从结构和功能得以恢复的机制，与其具有抗脂质过氧化损伤和清除自由基能力及有稳定细胞膜和膜性结构的作用有关。因而对黄芪的生物活性有待于进一步深入研究。

[参考文献]

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[2]王秀云.黄芪多糖的药理研究进展[J].现代保健:医学创新研究,2007(08Z):35-36.

[3]姜玉顺,金美善,吴耕书,等.乳鼠肝细胞的体外培养及组织化学观察[J].延边医学院学报,1988,11(4):253.

[4]李卫平,明亮,张艳.黄芪多糖耐缺氧作用的实验研究[J].安徽医科大学学报,1995,30(3):184．

[5]陈晓春,薛茜.大鼠脑缺血再灌注损伤及黄芪对脑细胞保护作用的实验研究[J].陕西医学杂志,2004,33(11):974-976．

[6]Yu DH, Duan YL, Bao YM, et al．Isoflavonoids from Astragalus mongholicus protect PC12 cells from toxicity induced by L-glutamate [J]. Journal of Ethnopharmacology,2005,98(1-2):89-94．

[7]曹春梅,张雄,陈莹莹,等.不同用途的心室肌细胞的分离[J].浙江大学学报(医学版),2003,32(1):51-55．

(收稿日期:2008-07-18)

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