置换型荧光偏振免疫检测除草剂丁草胺

摘要：建立了一种置换型荧光偏振免疫分析方法（DFPIA）检测水样中除草剂丁草胺。研究了不同结构示踪物对丁草胺DFPIA灵敏度的影响，优化筛选出一种荧光示踪物抗体组成的免疫复合物；考察了DFPIA置换反应动力学。所建立的DFPIA法特异性良好，检出限为22.6 μg/L，半数抑制浓度（IC50）为321.3 μg/L，检测范围为60～1472 mg/L，检测时间为12.5 min，添加回收率在88.1%～112.5%间，免疫复合物可以在4 ℃下稳定保存至少1星期以上。本方法适于环境水样中丁草胺的筛选检测。

关键词：荧光偏振免疫分析； 丁草胺

1引言

丁草胺（结构见图1）属于氯乙酰苯胺类除草剂，是一种高效芽前选择性除草剂，主要用于去除稻田杂草，是我国生产和使用量最大的除草剂品种之一。丁草胺在环境中稳定性强、残留期长，对环境和生物有一定的危害性[1]。目前，对除草剂的检测主要是以气相色谱或液相色谱为基础的方法[2，3]。尽管仪器分析法准确可靠，但前处理操作繁琐，需较高技能的专业人员操作，成本较高。近年来，快速、简便的免疫分析方法在农药残留分析领域的应用已成为研究热点之一[4]。

荧光偏振免疫分析（Fluorescence polarization immunoassay，FPIA）作为一种均相免疫分析方法，无需分离洗涤步骤，反应时间基本上取决于分析试剂加入的时间，为高通量、自动化免疫分析的实现展示了良好的应用前景[5，6]。 但目前在食品、环境污染物分析领域中研究应用很少[6～10]。本研究组曾建立了一种基于竞争原理的丁草胺荧光偏振免疫分析方法[8]，使用时先加入分析物和示踪物，然后加入抗体，标记抗原和分析物开始竞争结合抗体，平衡后进行检测。本研究采用基于置换原理的单试剂荧光偏振免疫分析方法（Displacement FPIA，DFPIA）检测丁草胺，预先将抗体和荧光示踪物混合制备出免疫复合物贮存待用，使用时只需将分析物加入，经短时间反应，测定荧光偏振信号。考察了结合反应动力学、置换反应动力学、方法特异性、稳定性、添加回收率等，建立了一种丁草胺DFPIA分析方法。2实验部分

2.1仪器与试剂

Wallac VICTOR3 1420多标记分析仪（美国Perkin Elmer公司）；U3010 紫外可见光谱扫描仪（日本Hitachi公司）；荧光微孔板（深圳金灿华实业有限公司）。丁草胺（分析纯，山东滨州农药公司）；牛血清的蛋白（BSA）、异硫氰酸荧光素异构体Ⅰ（FITC isomer Ⅰ）、5氨基荧光素（AF）、N，N′二环己基碳二亚胺（DCC）、N羟基琥珀酰亚胺（NHS）、乙二胺、己二胺（Sigma 公司）；其它试剂均为市售分析纯；硼酸缓冲液（BB溶液，50 mmol/L，pH 8.0）作为稀释液用于所有样品稀释。

2.2实验方法

2.2.1荧光示踪物制备

丁草胺半抗原BMPA、不同长度手臂的荧光示踪物BMPAAF、BMPAEDF和BMPAHDF（结构见图1），按照文献[8]的方法制备。

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