惠州客家人群食管癌EGFR蛋白表达及与MAPK信号通路相关性的初步研究

[摘要] 目的 检测EGFR在惠州客家人群食管癌组织的表达，探讨EGFR与惠州客家人群食管癌发生发展之间的关系及与MAPK信号传导激活状态的相关性。 方法 采用免疫组织化学及免疫蛋白印迹方法，检测53例惠州客家人群食管癌和癌旁正常组织标本中EGFR、MAPK（ERK1/2）和p-ERK1/2蛋白的表达。 结果 EGFR和p-ERK1/2在食管癌组织中的表达率显著高于癌旁正常组织（P < 0.01）；分化程度越低，EGFR和p-ERK1/2的表达越高；有淋巴结转移患者EGFR和p-ERK1/2的表达明显高于无淋巴转移者（P < 0.01）；浸润浅肌层患者的p-ERK1/2表达阳性率明显低于浸润深肌层（P < 0.05）。 结论 EGFR/MAPK信号传导与惠州客家人群食管癌的发生发展密切相关。伴随EGFR的过表达，MAPK（ERK1/2）信号通路活化水平升高，EGFR/MAPK信号通路可为食管癌的早期基因治疗提供新的靶点。

[关键词] 食管癌；惠州客家人群；EGFR蛋白；MAPK蛋白；信号传导

[中图分类号] R735.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）08（c）-0016-04

Preliminary study in Huizhou Hakka population of esophageal cancer EGFR protein expression and correlation with MAPK signaling pathway

PEI Xiaojuan1YANG Qingxu1ZOU Dongmei2ZHU Yingling1

1.Department of Pathology, Central People"s Hospital of Huizhou City, Guangdong Province, Huizhou516001, China；2.Chinese Medical Association Huizhou Dongjiang Pathology Diagnosis Center, Guangdong Province, Huizhou516001, China

[Abstract] Objective To investigate the expression of EGFR protein in esophageal cancer of Huizhou Hakka population, discussing the relationship EGFR and MAPK activation of signal transduction in the occurrence and development of esophageal cancer of Huizhou Hakka population. Methods Immunohistochemical staining and Western blot was employed to detect the expression of EGFR, MAPK and p-ERK1/2 protein expression in 53 cases of esophageal cancer and normal esophageal tissues adjacent to cancer. Results EGFR and p-ERK1/2 expression in esophageal cancer were significantly higher than in normal esophageal tissues adjacent to cancer (P < 0.01); the lower the degree of differentiation, the higher expression of EGFR and p-ERK1/2; expression of EGFR and p-ERK1/2 with lymph node metastasis patients were higher than who without lymph node metastasis (P < 0.01); positive expression rate of p-ERK1/2 with the superficial myometrial infiltration patients was remarkablely lower than that of depth of myometrial infiltration (P < 0.05). Conclusion EGFR/MAPK signal transduction is closely related to the occurrence and development of esophageal cancer in Huizhou Hakka population. Accompanied by EGFR over expression, elevating the level of activated MAPK (ERK1/2) signaling pathway, so EGFR /ERK proteins may to provide a new target for early gene therapy in Huizhou Hakka population esophageal cancer.

[Key words] Esophageal Carcinoma; Huizhou Hakka population; EGFR protein; MAPK protein; Signal transducation

研究表明，食管癌发病表现为一定的地域分布。河南林州市，广东省潮汕地区和梅州地区（客家人为主）为食管癌高发区。本课题组前期研究发现，惠州地区客家人群食管癌与PTEN/STAT1/3信号传导密切相关[1]，但信号传导通路极为复杂，是否EGFR/MAPK信号传导在惠州客家人群食管癌的发生发展过程中起重要作用，需要进一步探讨。表皮生长因子受体EGFR（epidermal growth factor receptor）属于细胞表面酪氨酸激酶受体erbB家族成员，在多种肿瘤如食管癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、子宫内膜癌中表达或高表达，并且EGFR高表达是肿瘤患者预后差的一个重要指标[2]。研究表明，EGFR配体有TGF-α、EGF、Epiregulin、β-cellulin等，配体与EGFR结合引起erbB家族成员内部同二聚体或异二聚体受体复合物形成，胞质区便自我磷酸化，启动相应的信号传导通路。受体复合物自我磷酸化可以激活几条潜在的EGFR信号传导通路，包括：Ras/MAPK、PI3K、PLC-γ和STAT四条主要的传导通路[3-4]。

有丝分裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶MAPK/ERKs（mitogenaetivated protein kinases/extracellular regulated kinases）信号传导通路异常在食管癌增殖过度与凋亡受阻中起重要作用。ERKs可被多种丝裂原信号和癌基因产物激活，转导信号至细胞及其核内，诱导细胞增殖和分化。Ras/MAPK通路是EGFR活化的一条重要信号转导通路，ERK1/2一旦活化，便从胞质进入胞核，磷酸化和活化核内的效应分子，最终启动与细胞增殖有关的靶基因的转录。研究表明，EGFR既介导促进细胞代谢、增殖、迁移，促进血管发生，抑制细胞凋亡的信号转导通路的活化，又介导抑制细胞生长、促进凋亡的信号转导通路的活化[5]。本研究检测53例惠州客家人群食管癌EGFR蛋白及MAPK（ERK1/2）蛋白的表达，初步探讨EGFR蛋白及MAPK（ERK1/2）与惠州客家人群食管癌发生发展的关系及其可能的与MAPK（ERK1/2）信号传导相关的机制。

1 材料与方法

1.1 标本来源

53例食管鳞癌标本取自2004年1月～2008年12月惠州市中心人民医院的食管癌患者53例（三代以内为惠州本地客家人，术前均未经放疗和化疗）。根据2006年WHO组织学新分类进行分类，其中Ⅰ级13例，Ⅱ级19例，Ⅲ级21例；有淋巴结转移21例，无淋巴结转移32例；侵及浅层（黏膜下层或浅肌层）29例，侵及深层24例。同时取上述患者癌旁切缘组织作为对照组。

1.2 主要试剂

兔源Anti-EGFR（1005）（Santa Cruz公司，美国），兔源Anti-MAPK（ERK1/2）及鼠源Anti-p-ERK1/2（SIGMA公司，美国），SP试剂盒（北京中山生物公司，中国）。

1.3 免疫组化染色

石蜡切片常规脱蜡至水，3% H2O2室温10 min，微波修复抗原后，滴加一抗：兔抗人EGFR（1∶200）；兔抗人MAPK（ERK1/2）（1∶500）；鼠抗p-ERK1/2（1∶500）；均4℃过夜。次日滴加羊抗兔/鼠二抗，37℃ 30 min；DAB显色，苏木精复染，脱水透明，封片。以PBS替代一抗作阴性对照。以含10%小牛血清1640培养的Hela细胞作为指标的阳性对照。采用HPIAS-1000高清晰度病理图文分析系统，随机观察染色清晰的10个高倍视野共计数1 000个癌细胞阳性的百分比，将阳性细胞所占百分比打分：0分为阴性，1分为<10%，2分为10%～50%，3分为51%～75%，4分为>75%。同时染色强度进行打分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。以两者乘积为最后得分：0分为阴性（-），1～2分为弱阳性（+），>3分为阳性（++）。

1.4 Western blot免疫印迹法检测蛋白表达

新鲜组织尽量剪碎（其中癌组织取实体瘤中心组织，癌旁正常组织仅取黏膜层），4℃ PBS冲洗，加入适量4℃ TritonX-100提取液以电动匀浆器匀浆（速度为11 000 r/min），其中癌组织匀浆1.5 min，癌旁正常黏膜匀浆4 min，玻璃匀浆器匀浆，每个组织匀浆20次再以超声波破碎细胞（每个标本240次，频率为间隔2 s，超声2 s，功率为300 W）；10 000 r/min 4℃离心5 min，取上清分装后冻存于-80℃备用。用Bradford法测定蛋白浓度。取100 μg蛋白点样于10% SDS-PAGE，电泳分离蛋白质，电印迹半干转移法转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉TBST溶液4℃冰箱封闭过夜，分别用一抗（EGFR工作效价1∶500；ERK1/2工作效价1∶1000、p-ERK1/2工作效价1∶1000稀释）与二抗孵育，DAB显色或洗膜后ECL发光显影，定影。硝酸纤维素膜经过洗脱去除二抗和一抗后，用β-actin抗体（作为内参）按上述同样方法检测。最后对胶片进行扫描，用Bio-Rad Quantity one软件分析测定其区带的灰度，并计算出与actin条带灰度值的比值。

1.5 统计学方法

应用SPSS 11.0统计分析软件，计数资料采用百分率表示，组间对比采用χ2检验。等级资料的相关性分析用非参数spearman等级相关检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR蛋白在惠州客家人群食管癌组织及癌旁正常组织中的表达

免疫组化结果示：53例癌旁正常食管黏膜上皮（距肿瘤边缘至少5 cm）仅见正常食管上皮基底细胞和间质细胞有低水平染色（+/-）（41例）和无EGFR表达（12例），基底层以上上皮细胞均呈EGFR阴性表达。53例食管癌组织中EGFR呈显著过表达（37例呈阳性表达，阳性率为69.81%），高于癌旁正常组织（P < 0.01），阳性表达信号主要位于癌细胞的胞膜和胞浆（图1、2）。实验结果表明：①分化程度越低，EGFR表达越高，在Ⅰ～Ⅲ级食管鳞癌组织中，EGFR蛋白阳性率随组织恶性程度增高而逐渐增加。②有淋巴结转移患者EGFR的表达明显高于无淋巴转移者（P < 0.01）。见表1、2。Western blot显示：食管癌及癌旁正常组织均表达EGFR，EGFR在食管癌组织中的表达远高于在癌旁正常组织中的表达（P < 0.05）。见图3。

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2.2 MAPK（ERK1/2）在惠州客家人群食管癌组织及癌旁正常组织中的表达

免疫组化显示，MAPK（ERK1/2）蛋白阳性免疫产物呈棕黄色，广泛分布于食管癌旁正常组织和食管癌细胞的胞浆内，少数可见核-浆表达。实验结果表明：不同分级、浸润深度及有无淋巴结转移患者食管癌组织中ERK1/2表达差异无统计学意义（P > 0.05）。（表1、2）。免疫组化及Western-blotting结果（图3）均显示：食管癌及癌旁正常组织均表达ERK1/2蛋白，图像分析和统计结果表明，ERK1/2在癌组织及癌旁正常组织中的表达差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.3 p-ERK1/2在惠州客家人群食管癌及癌旁正常组织中的表达

免疫组化显示：对p-ERK1/2的检测表明：53例癌旁正常组织均呈p-ERK1/2阴性或弱阳性表达，阳性信号主要以基底细胞的胞核最强。53例食管癌组织中p-ERK1/2的表达显著高于癌旁正常组织（P < 0.01），阳性信号位于癌细胞的细胞核（49例呈阳性，阳性率92.45%）（图4、5）。实验结果表明：①分化程度越低，p-ERK1/2表达越高，在Ⅰ～Ⅲ级食管鳞癌组织中，p-ERK1/2蛋白阳性率随组织恶性程度增高而逐渐升高；②有淋巴转移患者p-ERK1/2的表达明显高于无淋巴转移者（P < 0.01）。③浸润浅肌层患者p-ERK1/2表达的阳性率明显低于浸润深肌层患者（P < 0.05）（表1、2）。Western blot结果显示：癌组织强表达p- ERK1/2蛋白，相对于癌旁正常组织中的阴性或弱阳性表达有高度统计学意义（P < 0.01）。见图3。

3 讨论

EGFR/erbB1基因位于q7，为170～180 kDa的跨膜糖蛋白，由胞外配体结合区、跨膜区、胞内区（此区具有内在酪氨酸激酶活性）3部分组成。EGFR与其配体EGF等刺激信号结合后活化，启动其信号传导下游一系列的级联反应，引起核内基因转录水平增加，促进细胞的增殖分化。EGFR在肿瘤细胞中过表达或突变，导致细胞生长失控和恶性转化[4]。本实验结果显示：①癌旁正常食管黏膜上皮仅见正常食管上皮基底细胞和间质细胞有低水平染色（+/-），基底层以上的上皮细胞均呈EGFR阴性表达。②食管癌组织中EGFR呈明显的过表达（阳性率为69.81%），阳性表达信号主要位于癌细胞的胞膜和胞浆。在惠州客家人群食管癌组织中EGFR蛋白存在过表达，癌组织分化程度及有无淋巴结转移对其有影响，而癌浸润深度对其无影响。可能原因是存在着转录后调控或蛋白质修饰的异常，或存在个体差异、地域性的食管癌组织可能存在表达差异，这种差异有待于进一步进行流行病学及分子生物学的研究来证实。

Raf→MEK（MAPkinase）→MAPK/ERK信号级联是转导细胞内信号的最重要通路。ERKs使细胞外接信号传递到细胞核内而调节基因表达等多种过程。研究表明，ERK在很多恶性上皮肿瘤中存在过度激活[5]。Iwase等[6]发现p-ERK在鼠胚胎胃组织中及人类胃癌组织中呈高表达，表明p-ERK可促进胃黏膜细胞的增殖及恶性转化。Gu等[7]报道胃癌p-ERK蛋白表达明显高于正常胃黏膜，并且p-ERK蛋白过表达与肿瘤浸润深度，有无淋巴结转移及临床分期有关。本研究结果显示：ERK1、ERK2蛋白表达水平在食管鳞癌组织与癌旁正常黏膜组织无差异（P > 0.05），而p-ERK1、p-ERK2的表达水平却显著增高（P < 0.01），表明在惠州客家人群食管癌的发生发展过程中ERK1/2蛋白被磷酸化活化为p-ERK而发挥作用。可见，ERK1/2在正常情况下以非活性形式存在，被磷酸化活化为p-ERK后，在食管鳞癌发生、发展等信号转导途径中起重要作用。

Leu等[8]研究发现，表皮生长因子（epidermal growth fator，EGF）通过激活ERK1/2，上调凋亡抑制基因mcl-1表达而抑制食管癌细胞凋亡，说明ERK1/2过度活化与食管癌细胞增殖有关。持续活化的ERK1/2（P-ERK1/2）可激活周期调控基因CyclinD1和核转录因子c-myc，促使细胞由G1期向S期转化，进而诱导细胞增殖[9]。因此，在食管癌发生发展过程中，可能由于致癌因子或癌基因产物刺激，建立EGF/EGFR自分泌系统，使EGFR蛋白过表达，ERK1/2持续活化，而导致Ras/Raf/MEK/EKR信号通路的异常激活，细胞在转录水平增殖失控、凋亡受阻，使细胞发生恶性转化，并促进肿瘤的浸润和转移。可见，在食管癌进展中EGFR/ERK信号级联可能是食管癌的重要分子机制。但是，Barry等[10]研究发现在人食管胃恶性肿瘤转移的肋骨骨髓细胞系p-ERK1/2显著增多， MEK抑制剂PD98059和U0126不能阻滞ERK1/2活化，因而指出ERK1/2活化可能还有非Raf→MEK→MAPK/ERK机制，说明细胞内信号的转导是复杂和多样的，与肿瘤细胞增殖有关的ERK1/2活化是细胞内多条信号通路的汇聚点。

可见，ERK活化后从胞浆进入胞核是MAPK相关通路活化的重要组成部分，但是不能因此认为细胞核内有p-ERK的表达即认为ERK被活化。上述结果表明ERK通路的激活是食管癌发生的重要步骤，惠州客家人群食管癌中存在ERK的活化，p-ERK蛋白的表达与食管鳞癌的分化程度及癌细胞的浸润行为有关，可见，EGFR蛋白可能通过启动ERK1/2信号转录，在食管癌的发生发展中起重要作用。可为食管癌抑制ERK通路的抗肿瘤药物的靶向治疗提供新的思路和线索。

[参考文献]

[1] 裴小娟，邹冬梅，陶艳红，等.惠州客家人群食管癌PTEN蛋白表达及与STAT1/3信号通路相关性的初步研究[J].中华肿瘤防治杂志，2009，16（12）：885-889.

[2] Ratushny V，Astsaturov I，Burtness BA，et al. Targeting EGFR resistance networks in head and neck cancer [J]. Cell Signal，2009，1.[Epub ahead of print].

[3] Molaei M，Pejhan S，Nayer BN，et al. Human epidermal growth factor receptor-2 family in colorectal adenocarcinoma：correlation with survival and clinicopathological findings [J]. Eur J Gastroenterol Hepatol，2009，21（3）：289-293.

[4] Hanawa M，Suzuki S，Dobashi Y，et al. EGFR protein overexpression and gene amplification in squamous cell carcinomas of the esophagus [J]. Int J Cancer，2006，118（5）：1173-1180.

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[6] Iwase T，Tanaka M，Suzuki M，et al. Identification of proteintyrosine kinase genes preferentially expressed in embryo stomachand gastric cancer [J]. Biochem Biophys Res Commun，1993，194（2）：698.

[7] Gu J，Tmauar M，Ymaada KM. Tmuor supperssor PTEN inhibits integrin and growth factor-mediated mitogen-activated protein（MAP） kinase singaling phatways [J]. J Cell Biol，1998，143（5）：1375-1383.

[8] Leu CM，Chang C，Hu C. Epidermal growth factor（EGF）suppresses staurosporine-induced apoptosis by kinase pathway [J]. Oncogen，2000，19（13）：1665.

[9] Ma Yingyu，Yu Weidong，Kong Rui Xian，et al. Roleof nongnomic activation of phosphatidylinositol 3-kinase/Akt and mitogen-activated protein kinase/extracel-lular signal-regulated kinase，kinase/extracellular sig-nal-regulated kinase1/2 pathways in 1，25D3-midiated apoptosis in squamous cell carcinoma cells [J]. Cancer Res，2006，66（16）：8131-8138.

[10] Barry OP，Mullan B，Sheehan D，et al. Constitutive ERK1/2 activation in esophagogastric rib bone marrow micrometastatic cells is MEK-inde-pendent [J]. J Biol Chem，2001，276（18）：15537.

（收稿日期：2012-03-01 本文编辑：郝明明）

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