寄生软化汤诱导骨肉瘤小鼠的免疫效应

摘要 目的：探讨寄生软化汤对骨肉瘤小鼠免疫功能的诱导作用，为肿瘤的中药辅助治疗提供参考。方法：选取昆明种小鼠，随机分为模型给药组、模型组、空白模型组、正常组，其中模型给药组腹腔注射给予25mg/kg顺铂及给予13mg/kg寄生软化汤灌胃，模型组给予相同剂量的顺铂和生理盐水，空白模型组和正常组分别给予相同剂量的生理盐水。疗程结束后统计分析小鼠体重、肿块近似体积、脏器指数及T细胞亚群。结果：与模型组比较，寄生软化汤可明显提高骨肉瘤小鼠的体重及CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞百分率及CD4+/CD8+比值（P<0.05）。运用寄生软化汤的小鼠较模型组肿块体积减少，胸腺和脾脏指数增加，但变化并不显著。结论：寄生软化汤对骨肉瘤小鼠的免疫功能具有调节和诱导作用。中药与化疗联合治疗肿瘤可增强机体免疫功能，抑制肿瘤生长。

关键词 寄生软化汤；骨肉瘤；免疫功能；诱导作用；T细胞亚群；中药；化疗；联合治疗

AbstractObjective：ToinvestigatetheimmuneinducingactivityofJishengRuanhuaDecoctiononmicewithosteosarcomaandtoprovidereferencesforsynergetictreatmentoftumorwithtraditionalChineseMedicine.Methods：Kunmingmicewererandomlydividedintomodeladministrationgroup，modelgroup，blankmodelgroupandnormalgroup.Themodeladministrationgroupreceivedintraperitonealinjectionof25mg/kgcisplatinandintragastricadministrationof13mg/kgJishengRuanhuaDecoction，andthemodelgroupwasadministratedthesamedosagesofcisplatinandsalinewiththeblankmodelgroupandthenormalgroupbeinggiventhesamedosageofsalinerespectively.Aftertheendofthetreatmentcourse，thebodyweight，approximatevolumeoftumor，organsindexandTcellsubgroupswerestatisticallyanalyzed.Results：Comparedwiththemodelgroup，JishengRuanhuaDecoctioncouldsignificantlyincreasethebodyweightandthepercentageofCD3+Tcell，CD4+Tcell，CD8+TcellandCD4+/CD8+ratioofthemicewithosteosarcoma（P<0.05）.Furthmore，JishengRuanhuaDecoctioeducedthevolumeofthetumorandimprovedtheindexofthymusorspleenwithnoremarkablechanges.Conclusion：JishengRuanhuaDecoctioncouldregulateandinduceimmunefunctionofmicewithosteosarcoma.ThecombinationtreatmentofchemotherapyandtraditionalChinesemedicineenhancedtheimmunefunctionandinhibitedtumorgrowth.

KeyWordsJishengRuanhuaDecoction；Osteosarcoma；Immunefunction；Inducingactivity；Tcellsubgroups；TraditionalChinesemedicine；Chemotherapy；Combinationtreatment

中图分类号：R289.5；R738.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.06.050

骨肉瘤是儿童和青少年时期最常见的恶性肿瘤之一，伴有骨恶性度高、生长迅速、早期易转移且治疗后易复发等临床症状而成为医学上的一大难题[1-2]。据统计，即使采用现有的化疗/放疗及西医辅助治疗方案，骨肉瘤患者10年总生存率也仅有60%～70%，且在诊断时，约20%骨肉瘤患者已发生转移性疾病，严重影响人类的健康水平和生命质量，因此探寻延缓病程，改善疾病症状，提高生命质量的治疗方案迫在眉睫[3-5]。中医药与西医相比在对调理患者的全身状况，降低化疗的不良反应，提高手术和化疗的效果，调整脏腑失调，提高患者的免疫力等方面具有其独到之处[6]。本研究旨在通过统计治疗疗程结束后骨肉瘤小鼠体重、肿块近似体积、脏器指数及T细胞亚群的变化，分析其免疫状态，进而探讨寄生软化汤对骨肉瘤小鼠免疫功能的影响，为中药辅助治疗肿瘤提供临床依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物昆明种小鼠30只，SPF级，雄性，6～8周龄，体重（20.0±2.1）g，購于广州中医药大学实验动物中心。

1.1.2药物寄生软化汤包括党参12g、黄芪12g、白术9g、木香6g、川续断15g、狗脊12g、桑寄生12g、丹参15g、当归9g等多味中草药。上述中药水煎2次，浓缩至100mL，置于-4℃冷藏储存。寄生软化汤中草药均购于广州市中医医院。顺铂购于南京制药厂有限公司。

1.1.3试剂与仪器LM8骨肉瘤细胞株购自第四军医大学实验动物中心。新生牛血清RPMI1640培养液（含10%新生牛血清）为美国GIBCO产品。小鼠CD3+、CD4+、CD8+单克隆抗体购自上海江莱生物科技有限公司。EliteESP型流式细胞仪购于美国Coulter公司。

1.2方法

1.2.1分组与模型制备LM8骨肉瘤细胞株置于RPMI1640培养液中培养生长至90%融合时采用胰酶消化后计数，离心后弃上清，加PBS缓冲液混匀调整骨肉瘤细胞浓度为20×106个/mL。

实验分为模型给药组、模型组、空白模型组、正常组。随机选取24只小鼠，剪去左前腋下毛发，并采用碘液进行消毒处理。取LM8骨肉瘤细胞悬液0.25mL，注入小鼠左前腋窝皮下。皮下注射后每天肉眼观察，具有明显肿瘤结节时为造模成功。

1.2.2给药方法造模成功后开始给药，其中模型给药组分别2次/d腹腔注射给药25mg/kg顺铂（w/w，2.5mg/mL）及1次/d灌胃给药13mg/kg寄生软化汤（根据给药剂量换算，相当于临床成人用量的9倍）。模型组分别给予相同剂量的顺铂和生理盐水，空白模型组和正常组给予相同剂量的生理盐水。连续给药28d为1个疗程。每只小鼠每日灌胃量不超过1.0mL。

1.2.3检测指标与方法治疗疗程结束后称取小鼠体重，测量肿瘤的最长径a和横径b，并依据公式V=πab2/6，计算肿块的近似体积。实验小鼠摘眼球取血，采用肝素钠震荡进行抗凝处理，采用流式细胞仪测定T细胞亚群CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞百分率。实验小鼠取血后脱臼处死，摘取完整的胸腺和脾脏，滤纸吸干残血后称取质量，依据脏器指数=脏器质量/体重×100%。

1.3统计学方法

采用SPSS17.0统计软件对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1寄生软化汤对小鼠体重及肿块体积的影响

肿瘤对小鼠体重具有抑制作用，正常组小鼠体重与模型小鼠比较，差异有统计学意义（P<0.05）。模型给药组小鼠体重上升，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05），且小鼠自主活动增加，皮毛具有一定的光泽，表明寄生软化汤对小鼠体重增长具有促进作用。肿块近似体积数据显示，模型给药组、模型组肿块体积与空白模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05），但模型给药组与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2寄生软化汤对小鼠免疫功能的影响

2.2.1寄生软化汤对小鼠脏器指数的影响模型小鼠胸腺指数和脾脏指数与正常小鼠相比均有下降。与空白模型组比较，模型组小鼠脏器指数比较，差异无统计学意义（P>0.05），而模型给药组脏器指数显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.2.2寄生软化汤对小鼠T细胞亚群的影响与正常组比较，模型小鼠CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞百分率均显著下降，表明肿瘤损伤机体免疫功能。与模型组比较，模型给药组CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞百分率及CD4+/CD8+比值均显著增加，差异无统计学意义（P<0.05）。此外，模型组小鼠CD8+T细胞百分率、CD4+/CD8+比值与空白模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

3讨论

骨肉瘤患者，尤其是中晚期的化疗患者，其自身的免疫功能紊乱低下，而传统化疗对机体免疫系统又具有明显的抑制作用，给疾病的预后及治療带来诸多困难[7-8]。中药辅助化疗可明显缓解肿瘤患者的临床症状，改善生命质量及治疗耐受性，并在一定程度上控制肿瘤大小，延长患者生存时间，为肿瘤治疗提供新的思路与方法[9-11]。中药可通过激发、增强或恢复机体特异性或非特异性免疫效应机制，促进T细胞因子释放，诱导细胞凋亡，抑制血管生成，增加T细胞总数等途径达到抗肿瘤作用[12-13]。

寄生软化汤作为治疗骨肉瘤的中药方剂，具有活血消肿，攻坚散结，减毒增效的疗效，其含有多味补益正气，增强机体免疫功能的中草药，如党参、黄芪、白术、丹参等。单味中草药夏枯草的提取物对肿瘤细胞具有抑制作用[14]。Usami等[15]报道显示丹参提取物人参皂苷可以增加小鼠胸腺质量，抑制肿瘤细胞新生血管的形成和肿瘤细胞的转移，促进肿瘤细胞的凋亡。任杰红等[16]和孙睿等[17]研究人员发现人参皂苷可以提高正常小鼠胸腺和脾脏质量，提高机体免疫活性。本实验中，与模型组比较，寄生软化汤可以明显提高骨肉瘤模型小鼠的体重（P<0.05），使小鼠自主活动增加，皮毛具有一定的光泽。此外，口服寄生软化汤的模型小鼠肿瘤体积减小，胸腺和脾脏指数增加。同时接受寄生软化汤和化疗治疗的小鼠CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞百分率及CD4+/CD8+比值与单一化疗的模型组比较均显著增加（P<0.05），这表明寄生软化汤对骨肉瘤小鼠的免疫功能具有诱导作用，寄生软化汤与化疗联合治疗与单一化疗比较，联合治疗的抗肿瘤效果更佳。

任一时期的患者，即使是晚期恶性程度比较高的肿瘤患者，中医治疗也能起到提高患者生命质量，延长生命的作用。其用在手术前后也能有很好的治疗效果，防止癌细胞转移及扩散，提高手术的成功率，减少发生相应的并发症[18-20]。用在放疗和化疗后可以减少其不良反应，提升患者自身的免疫力，帮助患者完成整个治疗过程，提高治愈的概率。中医治疗采用药的药物通常是纯天然的中草药，药性较温和且无刺激，可以贯穿于患者整个治疗的过程。

实验研究表明，化疗与中药联合治疗在增强机体免疫功能，预防肿瘤转移与复发，改善患者临床症状和生命质量等诸多方面具有一定的疗效。李梅等[21]在探讨中药汤剂辨证施治联合生长抑素类似物治疗晚期胃肠胰腺神经内分泌肿瘤的疗效及安全性实验中证实中药汤剂辨证施治与生长抑素类似物在治疗晚期胃肠胰腺神经内分泌肿瘤方面具有协同作用，可减轻用药不良反应，可能延长患者的疾病进展时间。张江华等[22]研究表明环磷酰胺联合中药治疗具有抗癌、减轻骨髓抑制作用，拮抗环磷酰胺的不良反应及进一步延长荷瘤小鼠寿命的作用。此外，很多中药单体联合应用西药能调节P53、Bcl-2基因家族、c-myc等细胞凋亡基因的表达，从而有效地诱导肿瘤细胞的凋亡[23-25]。

综上所述，寄生软化汤对骨肉瘤小鼠的免疫功能具有调节和诱导的作用，采用中药与化疗联合的方法治疗肿瘤可改善患者的生命质量，抑制肿瘤的生长，增强患者的免疫功能，为肿瘤的中药辅助治疗提供了重要的临床参考。

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（2017-12-21收稿责任编辑：杨觉雄）

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