CK20信息RNA及CK20蛋白在结直肠癌患者中的表达及与预后的相关性研究

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【摘要】目的：探讨CK20信息RNA及CK20蛋白在结直肠癌患者中的表达及与预后的相关性。方法：选择2016年6月-2018年4月手术治疗结直肠癌患者60例作为对象，设为观察组，术中取病灶组织及癌旁组织（距离肿瘤≥5cm）;另选正常结直肠组织46例，设为对照组。采用RT-PCR法测定不同组织CK20信息RNA水平;采用免疫组织化学法测定各组CK20蛋白表达水平;统计并记录观察组年龄、性別、肿瘤直径、肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移、预后等资料，分析不同病理资料下CK20信息RNA及CK20蛋白表达水平并完成多因素Logistic分析。结果：观察组癌旁组织与对照组CK20信息RNA及CK20蛋白阳性率差异无统计学意义（P>0.05）;观察组病灶组织CK20信息RNA及CK20蛋白阳性率，均高于癌旁组织及对照组（P<0.05）;多因素Logistic分析结果表明：观察组结直肠癌组织中CK20信息RNA及CK20蛋白阳性率与性别、年龄、肿瘤部位无统计学意义（P>0.05）;观察组结直肠癌组织中CK20信息RNA及CK20蛋白阳性率与肿瘤大小、分化程度、肿瘤分期、淋巴结转移及预后具有统计学意义（P<0.05）。结论：CK20信息RNA及CK20蛋白在结直肠癌患者中呈高表达，能反映患者疾病严重程度，与预后存在相关性。

【关键词】CK20信息RNA;CK20蛋白;结直肠癌;多因素Logistic分析;相关性

【中图分类号】R541.4【文献标志码】A【文章编号】1005-0019（2019）02-017-01

结直肠癌均为临床上常见的恶性肿瘤，发病早期临床症状不典型，且随着病情的不断发展，多表现为排便习惯改变、便血、腹泻、局部腹痛等，晚期可表现为贫血、体重减轻等，影响患者健康及生活[1]。临床研究表明[2]：早期局限性CRC患者5年生存率超过90.0%，但是早期确诊率低于40.0%，多数患者确诊时已经达到中、晚期，丧失最佳治疗时机。CK20属于细胞角蛋白家族成员之一，具有严格的上皮组织特性，且主要分布在胃、肠粘膜细胞及相应的癌细胞中，但是在结直肠癌患者中的表达及与预后的相关性研究较少[3]。因此，本文采用随机对照方法进行研究，探讨CK20信息RNA及CK20蛋白在结直肠癌患者中的表达及与预后的相关性，报道如下。

1资料与方法

1.1临床资料

选择2016年6月-2018年4月手术治疗结直肠癌患者60例作为对象，设为观察组，术中取病灶组织及癌旁组织（距离肿瘤≥5cm），男34例，女26例，年龄（39-73）岁，平均（56.81±4.69）岁;肿瘤大小（1-9）cm，平均（4.51±0.74）cm;分化程度：高分化23例，中分化20例，低分化17例;肿瘤分期：I-II期35例，III-IV期25例;肿瘤部位：结肠41例，直肠19例;淋巴结转移：是16例，否44例。另选正常结直肠组织46例，设为对照组，男27例，女19例，年龄（40-74）岁，平均（57.07±4.73）岁，两组临床资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2方法

（1）CK20信息RNA。采用RT-PCR法测定不同组织CK20信息RNA水平。分别取观察组病灶组织、癌旁组织及对照组组织，经PBS进行冲洗后加入500uL trizol吹打，使得组织充分溶解，加入500uL trizol充分混合、均匀。将上述溶液放入体温5min下使得蛋白体充分解体，加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，常温下放置2-3min，15min离心，速度12000rpm，获得三层液体（上层为水相、中间层与下层为有机相）。取RNA沉淀，转移到新的EP管中，加入0.5mL异丙醇，充分混合后放置在-20℃冰箱中，10min离心，速度为12000rpm，可见凝胶状沉淀（即为RNA）。充分洗涤RNA，并加入250uL DEPC与750uL乙醇，利用乙醇完成沉淀的冲洗，5min离心，速度为7400rpm，取沉淀放入工作台上进行20min干燥。利用紫外分光度仪检测RNA浓度并完成RNA提纯（以Rnase作为空白对照），在A260下测定吸光度值。采用Dnase酶处理RNA，处理完毕后放入冰箱中，备用。②PCR反应。检测CK20信息RNA表达量。CK20上游引物5"-GGCTCTCCAGAACATCAT-3";下游引物：5"-CACCTGGTGCTCAGTGTA -3"。β-actin 鼠抗人单克隆抗体。β-actin 上游引物5’-GGCACACTCCAAGCGCTGAGAATG-3’。β-actin 下游引物 5’ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’设定反应条件：30℃，10min;42℃，30 min;99℃，5 min;5℃，5 min，连续进行35个循环，最后72℃下完成10min延长。选择获得的扩增产物，放入1.5%琼脂凝胶进行电泳，完毕后采用UVP凝胶图像完成灰度值的测定，β-actin为内对照[4]。

（2）CK20蛋白表达水平。采用免疫组织化学法测定各组CK20蛋白表达水平。①检测方法。分别取观察组病灶组织、癌旁组织及对照组组织，加入蒸馏水与浓度为30.0%H2O2，常温下加入内源性酶并进行10min灭火，PBS连续进行3次洗涤。将最终获得的切片放置在0.01M枸橼酸盐缓冲液中，加入生理盐水控制溶液PH最终为6。电炉加热直到煮沸，5min间隔后再次煮沸，常温下冷却。采用PBS2次洗涤，每次5min，最后加入5%BSA封闭液并加入加入兔抗人CK20蛋白抗体（1：100），兔抗人CK20蛋白一抗，一滴。滴加完毕后进行3次PBS洗涤;在1mL底物中加入兔抗人CK20蛋白二抗一滴，混合后常温下显色，苏木素复染后封片，倒置显微镜下观察细胞数量，每份标本测定三次，取平均值;②判断方法。参考奥尔雷德评分标准分别从细胞的阳性数量（阳性细胞数≤25.0%0分，26%-50.0%1分，51%-75%2分，>75%3分）、染色强度（不着色0分，黄色1分，棕黄色2分，黄褐色3分）完成免疫组化染色评分，总分16分，阳性率越高[5]。（3）不同病理下CK20信息RNA及CK20蛋白表达水平。统计并记录观察组年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移、预后等资料，分析不同病理资料下CK20信息RNA及CK20蛋白表达水平并完成多因素Logistic分析。

1.4统计分析

采用SPSS18.0软件处理，计数资料行χ2检验，采用n（%）表示，计量资料行t检验，采用（x±s）表示，P<0.05差异有统计学意义。

2结果

2.1两组CK20信息RNA及CK20蛋白阳性率比较

观察组癌旁组织与对照组CK20信息RNA及CK20蛋白阳性率差异无统计学意义（P>0.05）;观察组病灶组织CK20信息RNA及CK20蛋白阳性率，均高于癌旁组织及对照组（P<0.05），见表1及图1。

2.2观察组不同病理下CK20信息RNA及CK20蛋白阳性率比较

观察组结直肠癌组织中CK20信息RNA及CK20蛋白阳性率与性别、年龄、肿瘤部位无统计学意义（P>0.05）;观察组结直肠癌组织中CK20信息RNA及CK20蛋白阳性率与肿瘤大小、分化程度、肿瘤分期、淋巴结转移及预后具有统计学意义（P<0.05），见表2。

3讨论

结直肠癌是临床上常见的恶性肿瘤，发病早期临床症状缺乏典型性，多数患者确诊时已经是中晚期，丧失了最佳治疗时机[6]。临床研究表明[7]：肿瘤细胞微转移是肿瘤转移的重要途径，亦是患者手术失败的重要原因。微转移发展为临床转移过程主要是微量肿瘤细胞从原发病灶脱离，逃避机体免疫监控，侵袭正常组织，存活并增殖，从而引起肿瘤生长。因此，微转移转归取决于细胞的生物学特性、机体的免疫状态及宿主器官的微环境。CK起源于上皮细胞，是上皮细胞骨架的重要组成部分，可以分为酸性CK与碱性CK两种，多表达与正常上皮、上皮源性原发及转移的肿瘤细胞中，是上皮分化最为可靠的标记物[8]。本研究中，观察组病灶组织CK20信息RNA及CK20蛋白阳性率，均高于癌旁组织及对照组（P<0.05），说明CK20信息RNA及CK20蛋白在结直肠癌患者中呈高表达，能直接参与疾病的发生、发展。临床研究表明：CK系列是检测循环癌细胞的敏感标记物，且CK19与CK20最为广泛。CK20属于碱性CK，含有8个外显子、7个内含子，主要局限在胃肠上皮细胞中，且在正常的血液、骨髓、淋巴结中均无表达，具有高度的敏感性、特异度，表达水平相对稳定，是判断结直肠癌是否发生微转移的重要参数。因此，临床上加强结直肠癌患者CK20信息RNA及CK20蛋白表达能反映患者疾病严重程度，有助于评估患者预后，指导临床治疗。

综上所述，CK20信息RNA及CK20蛋白在结直肠癌患者中呈高表达，能反映患者疾病严重程度，与预后存在相关性。

参考文献

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[2]黎三艳，陈虹，王行富，等.膀胱乳头状尿路上皮肿瘤中CD10和CK20的表达[J].临床与实验病理学杂志，2016，32（10）：1113-1117.

[3]Altreetacha D， Tyrrell J， Haas T. CDH17 Is a More Sensitive Marker for Gastric Adenocarcinoma Than CK20 and CDX2.[J]. Archives of Pathology & Laboratory Medicine， 2016， 141（1）：144-150.

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[5]王大巍，孙立辉，樊毅，等.肠系膜下动脉周围淋巴结及自主神经分布在直肠癌根治术中的意义[J].中国老年学杂志，2016，36（3）：641-644.

[6]郭春红，成科，唐源，等.結直肠癌卵巢转移组织中CDX-2与CK7和CK20的表达及其临床意义[J].肿瘤预防与治疗，2016，29（6）：310-314.

[7]王佳雷，李霖.结直肠癌周围淋巴结CK20蛋白检测的临床应用研究[J].川北医学院学报，2017，32（1）：82-85.

[8]李勇，姜世平，高霞.Ki67和CK20及CEA的表达与结直肠癌临床病理特征的关系及意义[J].中国现代普通外科进展，2017，20（5）：394-396.

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