5—氮杂—2'—脱氧胞嘧啶核苷对肿瘤细胞化疗敏感性的作用研究

目前，许多肿瘤常规化疗效果差，预后不良是困扰临床的重要难题，而肿瘤多药耐药性（MDR）则是肿瘤化疗失败的关键因素。经治疗后，残存的肿瘤干细胞耐药性形成，常导致对某些药物治疗敏感性降低，并引起肿瘤复发甚至转移，因此MDR已成为当今医学界研究的热点[1]。

国内外均有大量文献表明5-氮杂-2"-脱氧胞嘧啶核苷能增强化疗药物对肿瘤细胞的作用，即降低肿瘤细胞的耐药性[2]。虽然早期应用于血液病，但在实体肿瘤中也有不同的作用机制来增强传统化疗药物的敏感性，为临床上对抗肿瘤多药耐药提供了新的思路。

1 5-氮杂-2"-脱氧胞嘧啶核苷（地西他滨）的发展历史

5-氮杂胞苷、5-氮杂-2"脱氧胞苷（地西他滨）最广泛的应用于DNA的去甲基化。在体内外，脱甲基作用导致遗传学上沉默的肿瘤抑制因子惯序地激活。尽管地西他滨作有抗白血病的作用被发现已有40年历史，它在恶性血液病的治疗潜力仅仅最近才被批准用于高风险的骨髓增生异常综合征以及作为年龄>65岁、非加强化疗的急性髓性白血病患者的一线用药。一些临床试验显示小剂量地西他滨在治疗慢性粒细胞白血病和血红蛋白病也有潜力，然而对实体肿瘤的疗效有限。临床反应似乎在表观遗传学、细胞周期阻滞和/或细胞凋亡都有表现。最近的和进行中的临床试验探讨新的给药方案、给药途径以及地西他滨与其他药物的配伍，这些药物包括组蛋白脱乙酰酶抑制剂[3]。

2 5-氮杂-2"-脱氧胞嘧啶核苷（地西他滨）作用机制

5-氮杂-2"-脱氧胞嘧啶核苷（5-aza-2"-deoxycytidine，5-Aza-cdR）即地西他滨（decitabine）是一种天然的脱氧胞苷酸的腺苷类似物。在细胞内，经磷酸化后与肿瘤内的胞嘧啶竞争，以共价键与DNA甲基化转移酶结合，使DNA甲基化转移酶失活，阻断细胞周期，抑制细胞增殖，从而发挥抗肿瘤的作用。临床研究发现小剂量的地西他滨对肿瘤的治疗有效，相对的实验室研究认为小地西他滨使DNA甲基化转移酶失活，诱导肿瘤细胞向正常细胞分化[4]。

目前肿瘤的耐药性是临床上的难题，也是肿瘤患者预后不良的一个重要因素[5]。在遗传学上，存在基因改变。而在表观遗传学上，DNA序列没有改变，只是基因被甲基化修饰，抑制基因的表达[6]。在哺乳动物基因组中，胞嘧啶含量仅为1%。这是因为胞嘧啶容易被甲基化成为5-甲基胞嘧啶。当癌基因低甲基化、抑癌基因高甲基化时，癌基因过度表达，导致肿瘤的发生[7]。已有大量文献表明5-氮杂-2"-脱氧胞嘧啶核苷能增强化疗药物对肿瘤细胞的作用，即降低肿瘤细胞的耐药性，现大致综述如下。

2.1肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。目前没有有效地药物干预能治疗肝癌[8]。大多数恶性肿瘤表现出异常基因启动子区域的甲基化导致基因功能的丧失[9]。去甲基化试剂5-Aza-CdR可以重新激活MAT1A基因表达和抑制MAT2A基因表达，诱导人肝癌细胞生成相同的产物，扭转MAT1A启动子的甲基化，从而它抑制肝癌细胞的生长。研究结果可以提供一个机制，通过5-Aza-CdR对肝癌细胞发挥持续增长的抑制作用[10]。在肝癌细胞中，丢失了表观遗传学修饰的癌细胞对放化疗缺乏应答。甲硫氨酸腺苷转移酶1A在肝癌细胞中是灭活的，它的灭活可能是基因的表观遗传学改变，这些改变中包括启动子甲基化。因此，药物解放表观遗传学的抑制作用可能逆转这个过程[11]。Liu，W.J研究了去甲基化试剂5-氮杂-2"脱氧胞苷在肝癌细胞Huh7细胞系中对MAT1A基因表达、DNA甲基化和腺苷甲硫氨酸产生的影响。我们发现在经5-氮杂-2"脱氧胞苷干预的肝癌细胞Huh7细胞系中，MAT1A mRNA和蛋白的表达激活，启动子甲基化也逆转了。同时也发现经5-氮杂-2"脱氧胞苷处理后的肝癌细胞Huh7细胞系中，MAT2A mRNA和蛋白的表达显著减少，腺苷甲硫氨酸产物也显著减少。然而，5-氮杂-2"脱氧胞苷对MAT2A甲基化没有作用。此外，5-氮杂-2"脱氧胞苷通过下调Bcl-2、上调Bax、caspase-3来抑制肝癌Huh7细胞系的增殖、诱导凋亡。我们的观察值显示5-氮杂-2"脱氧胞苷在肝癌Huh7细胞系中通过改变基因的表观遗传增加甲硫氨酸腺苷转移酶1A的表达以及诱导活性腺苷甲硫氨酸的产生发挥了抗肿瘤作用[12]。

2.2有前期的实验室和临床数据显示使DNA去甲基化的药物有潜在地减少铂抵抗型卵巢癌的发展[13]。为此，Glasspool，R.M测试了DNA低甲基化试剂5-氮杂-2"脱氧胞苷（地西他滨）可逆转卡铂抵抗的复发性卵巢癌的女患者这个假说。在卵巢癌中，mir-130b基因表达水平的下调与临床分期达到III-IV期和组织学分化较差的肿瘤有关。mir-130b的表达能够抑制多药耐药卵巢癌细胞。恢复mir-130b的表达可以使抗癌药物敏感性增强。目前的研究发现mir-130b基因甲基化水平与卵巢癌组织以及耐药细胞系负相关的表达式。脱甲基的5-aza-CdR导致激活mir-130b在耐药卵巢癌细胞株的表达，从而增加顺铂和紫杉醇的感性。在这个化疗计划中，在部分铂抵制的卵巢癌患者添加地西他滨是降低还是增加卡铂化疗的有效性很难区分。在未来的联合用药研究中，患者的选择，不同的化疗方案或者不同的去甲基化试剂都需要考虑进来[14]。

2.3横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤是儿童最常见的肉瘤[15]。尽管使用标准的疗法，将近有1/3的尤因氏肉瘤的患者复发，并且复发后有治疗潜力的药物极其有限。免疫疗法是一种有潜力的治疗方法[16]。它以肿瘤特异抗原为靶，保留正常细胞。已经有文献[17]证实去甲基化试剂5-氮杂-2"脱氧胞苷（地西他滨）可以上调睾丸癌抗原、人类主要组织相容性复合体分子、细胞内细胞粘附分子-1在儿童肉瘤细胞系中的表达，结果加强了儿科骨肉瘤患者睾丸癌抗原特异的细胞毒性T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的作用。按药理学剂量水平的地西他滨处理骨肉瘤细胞系后，在mRNA水平也有重要的表达增加，MAGE-A1和MAGE-A3达到70%，NY-ESO-1达到80%。在停止地西他滨干预>30 d后，在肉瘤细胞系和原发肿瘤细胞系MAGE-A1、MAGE-A3、NY-ESO-1依然维持高表达。此外，在用地西他滨研究过的9个细胞系中，有7个诱导上调MAGE-A1、MAGE-A3、NY-ESO-1蛋白的表达。这些研究表明在治疗儿科骨肉瘤时，可联合使用去甲基化试剂和睾丸癌抗原诱导的免疫疗法[18]。

2.4对于进展期的前列腺癌去雄激素治疗是最基本的治疗方案。然而，通过最初的回归分析，大多数患者不可避免的发展成致命的非雄激素依赖型肿瘤[19]。因此，弄清楚非雄激素依赖型前列腺癌的转变机制对治疗不能进行传统化疗的老患者确定新的治疗方案是很要紧的。[20]Wang-X验证了在LNCaP和PC3了两种细胞系中，5-氮杂-2"脱氧胞苷诱导细胞凋亡并增加miR-146a的表达。miR-146a的表达在LNCaP细胞系比PC3细胞系中更高。在5-氮杂-2"脱氧胞苷处理的细胞中MiR-146a抑制剂抑制了细胞凋亡。在移植了LNCaP细胞系的阉割鼠模型中，5-氮杂-2"脱氧胞苷显著地抑制了肿瘤生长，也抑制了前列腺癌的进展。同时，在经过5-氮杂-2"脱氧胞苷处理的移植鼠皮下的雄激素依赖型肿瘤中，MiR-146a表达也显著地增强，而在非雄激素依赖的阉割鼠移植肿瘤的各各阶段中却不是这样。尤其在用5-氮杂-2"脱氧胞苷和雄激素联合处理的各各阶段中，MiR-146a的表达显著扩增。此外，在miR-146a启动子结合部位的两个CpG位点（-444bp和-433bp）的去甲基化百分比显示在联合处理肿瘤的各各阶段CpG位点去甲基化水平最低。通过5-氮杂-2"脱氧胞苷处理低甲基化的miR-146a启动子上调miR-146a的表达，与延缓雄激素抵抗的前列腺癌有关。此外，在雄激素依赖的前列腺癌进展成非雄激素依赖的前列腺癌中，位点专一的DNA甲基化对miR-146a的表达有重要作用。因此为评价前列腺癌的药效提供了潜在的有用的生物学标记物[21]。

2.5膀胱癌是高复发的肿瘤，需要行特殊的经尿道切除术和膀胱内灌注化疗[22]。目前临床上发现膀胱肿瘤对传统化疗药物存在多药耐药性，这也就促使我们更加努力地寻找新的治疗药物和早期诊断工具[23]。蛋白表达的特殊改变可以提供诊断膀胱肿瘤标志物。在人膀胱癌细胞，5-氮杂-2"脱氧胞苷增加了GSTM1 mRNA和蛋白的表达。这些数据表明在泌尿上皮肿瘤中GSTM1的下调是膀胱肿瘤发生的标志物，并且这可以被基因的去甲基化所调 节[24]。目前也有相关文献报道，5-氮杂-2"脱氧胞苷对膀胱肿瘤T24细胞生物学行为有影响，肿瘤细胞凋亡增加。膀胱肿瘤中XIFI基因表达水平上调，XIAP基因无明显改变，XAF-1蛋白表达上调、NF-KBP65蛋白上调，并且与5-氮杂-2"脱氧胞苷有明显的剂量效应关系[25]。

3结论

肿瘤的发生、发展是多基因作用的结果，当然这些作用机制在各个肿瘤中不是唯一的，其他指标也有改变，有待我们进一步研究。同时为我们在临床上遇到肿瘤耐药情况提供了新的联合用药思路。

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