c—Myc、k—Ras、p16在胆囊癌细胞中的表达及临床意义

材料与方法

临床资料

收集上海交通大学附属第九人民医院奉城分院2010年3月-2013年3月行胆囊癌根治术20例患者的胆囊癌标本，其中男8例，女12例，年龄50～82岁，平均58.6岁。同时收集慢性胆囊炎患者50例和正常胆囊者20例（复旦大学附属中山医院肝移植供肝捐赠）的胆囊标本。

研究方法

胆囊癌组织按UICC标准分级及TNM分期，采用SP法检测c-Myc、k-Ras及p16在胆囊癌、慢性胆囊炎和正常胆囊细胞中的表达。标本置4%甲醛溶液中固定12 h，脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋，4 μm连续切片，操作按试剂盒说明书进行。兔抗人c-Myc、k-Ras及p16多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，工作浓度1：50。用同一指标阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

结果判定

c-Myc、k-Ras及p16蛋白表达以胞质中或胞核中出现棕黄色颗粒为显色。染色结果根据染色强度和阳性细胞面积进行半定量分析。染色强度：棕褐色为3分，棕黄色为2分，浅黄色为1分，不着色为0分。阳性细胞面积计算：阳性细胞占总面积≤10%为0分，11%～25%为1分，26%～50%为2分，≥51%为3分。两项指标相加分数分为4级：0～1分“-”；2分为“+”；3～4分为“++”；5～6分为“+++”。 “-”和“+”为阴性；“++”和“+++”为阳性。设置阳性和阴性对照以保证染色结果的可靠性。

统计学处理

采用SPSS12.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

c-Myc、k-Ras 、p16蛋白表达

在胆囊癌细胞中c-Myc和k-Ras染色均一（图1c、图2c），虽然在正常胆囊和慢性胆囊炎细胞也可见染色，但颜色普遍较浅（图1a、1b， 图2a、2b）。在正常胆囊细胞中p16染色均一（图3a），在慢性胆囊炎细胞中染色较浅（图3b），而在胆囊癌细胞中则呈弱表达（图3c）。

c-Myc、k-Ras、p16表达与临床病理特征关系

c-Myc、k-Ras表达与胆囊癌患者年龄、性别、肿瘤位置无关（P>0.05），而c-Myc表达与肿瘤大小、分化和淋巴结转移密切相关（P<0.05）；k-Ras表达与肿瘤大小、侵犯深度和淋巴结转移密切相关（P<0.05，表1）。

讨论

c-Myc是myc原癌基因族中的一员，定位于人染色体8q24。c-myc癌基因转录产生的mRNA，由细胞核转入细胞质，翻译成c-Myc蛋白。细胞受生长因子刺激或c-myc癌基因被异常激活后，c-Myc蛋白的表达明显升高，引起细胞增殖，同时抑制与分化有关的基因表达，降低细胞的终末分化。Crozo等[4]发现，在乳腺癌发病中c-Myc引起的细胞周期调控异常是较晚期的分子事件，在乳腺浸润性癌组织中发现c-Myc基因扩增，而在乳腺良性和正常组织中未有发现，说明c-Myc基因过度表达可能参与了肿瘤的发生、进展过程。在本研究中，c-Myc蛋白在正常胆囊、炎症性胆囊均呈弱表达，而在胆囊癌中表达明显增高，说明在胆囊癌的演变过程中c-Myc基因可能被激活，导致细胞周期增殖失控。

k-Ras定位于染色体12p11.1-p12.1，基因产物为ras-21蛋白，具有三磷酸鸟苷酶活性，并能与GTP结合。点突变激活的ras基因所表达的rasp21蛋白的GTP酶活性降低，使p21蛋白与GTP结合时间延长，对细胞产生持续性刺激，使细胞产生持续增殖和恶性转化，在控制细胞生长和分化中起重要作用。刘海林等[5]通过MASA方法检测血浆DNA中k-Ras基因第12密码子的突变，结果在7例胆囊癌中，5例k-Ras基因突变阳性（71.4%）。k-Ras基因为原癌基因，在正常组织中可有一定表达，k-Ras基因经过突变以后，在组织中出现异常表达。Dobrzycka等[6]报道k-Ras基因阳性表达率在肿瘤组织中增加。在本研究中，k-Ras蛋白在正常胆囊和炎症性胆囊中均有表达，但在胆囊癌中表达明显上升，提示k-Ras癌基因激活是胆囊癌发生的重要因素。

p16蛋白为细胞周期素依赖性激酶（CDK）的抑制蛋白。近来研究认为，细胞周期失调是癌变的重要原因。p16蛋白能与CDK4结合，抑制CDK4/周期蛋白D复合物的催化活性，从而阻止细胞从G1期进入S期，抑制细胞增殖，在肿瘤的发生过程中起负性调节作用[7]。已发现在很多肿瘤中有p16基因的缺失和p16蛋白表达水平下降，提示p16基因的改变与很多人类恶性肿瘤的发病机制有关。本研究中p16蛋白在胆囊癌细胞的表达明显低于慢性胆囊炎和正常胆囊细胞，提示在胆囊癌发生过程中发生p16失活。

综上所述，本研究中c-Myc、k-Ras蛋白表达与胆囊癌的恶性表型TNM分期、分化程度、淋巴结转移密切相关，进一步证实c-Myc、k-Ras蛋白的过表达参与了胆囊癌的发展，提示可作为术后预测胆囊癌患者复发与转移的重要指标。

参考文献

Hundal R ， Shaffer EA. Gallbladder cancer： epidemiology and outcome[J]. Clin Epidemiol， 2014，6： 99-109.

殷保兵 原发性胆囊癌的早期诊断[J]. 上海医药， 2014， 35（14）： 12-14.

石景森， 杨毅军. 原发性胆囊癌与胆囊结石关系研究的新进展[J]. 中华普通外科杂志， 2000， 15（6）： 373-374.

Crozo C， Corominas JM， Tusquets I， et al. The MYC oncogene in breast cancer progression： from benign epithelium to invasive carcinoma[J]. Cancer Genet Cytogenet， 2006， 165（2）： 151-156.

刘海林， 渡边弘之， 泽武纪雄. 血浆K-ras基因突变检测对胆道系统癌的诊断意义[J]. 临床肝胆病杂志， 2000， 16（3）： 164-166.

Dobrzycka B， Terlikowski SJ， Mazurek A， et al. Circulating free DNA， p53 antibody and mutations of KRAS gene in endometrial cancer[J]. Int J Cancer， 2010， 127（3）： 612-621.

Hu B， Jarzynka MJ， Guo P， et al. Angiopoietin 2 induces glioma cell invasion by stimulating matrix metalloprotease 2 expression through the alphavbeta1 integrin and focal adhesion kinase signaling pathway[J]. Cancer Res， 2006， 66（2）： 775-783.

（收稿日期：2014-07-12）

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