结肠癌细胞株SW480中CD133+的分选及Bmi—1基因的表达

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【摘要】 目的：观察结肠癌细胞株SW480中CD133+和CD133-细胞的肿瘤干细胞样生物学特性，并分析CD133+和CD133-细胞中Bmi-1基因的表达量的差异。方法：采用流式细胞仪分选出CD133+和CD133-细胞，观察对比CD133+和CD133-细胞体外成球能力及增殖能力。用Real-time PCR检测CD133+和CD133-细胞中Bmi-1基因的表达量。结果：（1）SW480细胞中CD133+细胞所占比例为7.02%。（2）CD133+细胞体外无血清培养4 d后可成球且速度生长；CD133-细胞在干细胞培养基中不能形成细胞球，但在含血清的培养基中能贴壁分化，连续传代。无血清培养基中，CD133+细胞增殖能力强于CD133-细胞。（3）Bmi-1 mRNA在CD133+细胞的中表达显著高于CD133-细胞。结论：结肠癌细胞株SW480中CD133+所占比例很少，但其增殖能力强，Bmi-1 mRNA在CD133+细胞的中高表达，可能与肿瘤的发生发展有关。

【关键词】 肿瘤干细胞； 结肠癌； Bmi-1基因； CD133+

【Abstract】 Objective：To observe the cancer stem cell like characteristics of CD133+ and CD133- in colon cancer cell line SW480，and to analyze the differences of expressions of Bmi-1 gene in CD133+ and CD133- cells.Method：CD133+ and CD133- cells were sorted by flow cytometry，the abilities of sphere-forming and cell proliferation of CD133+ and CD133- cells in vitro were observed.The expressions of Bmi-1 gene in CD133+ and CD133- cells were detected by Real-time PCR.Result：（1）CD133+ cells accounted for 7.02% in SW480.（2）CD133+ cells were formed spheres within 4 culture days and grow fast in vitro.CD133-cells can not formed spheres，but can adhered and differentiated in medium with serum.In serum-free medium，the abilities of proliferation in CD133+ cells were bigger than those in CD133 cells.（3）The expressions of Bmi-1 mRNA in CD133+ cells were significantly higher than those of CD133- cells.Conclusion：The CD133+ cells account for a little proportion in SW480，but have the higher abilities of proliferation.Bmi-1 mRNA express highly in CD133+ cells，may be related to the carcinogenesis.

【Key words】 Cancer stem cell； Colon cancer； Bmi-1 gene； CD133+

First-author’s address：The Affiliated Guangzhou First People’s Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510180，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.17.006

结肠癌是临床常见的大肠恶性肿瘤，现阶段结肠癌的主要治疗手段包括有手术治疗和化疗，但效果均难以令人满意，结肠癌患者的长期生存率比较低下，大部分是因为肿瘤复发[1]。研究发现肿瘤复发可能与肿瘤内存在少量肿瘤干细胞相关。肿瘤干细胞具有无限增殖和自我更新的能力，在肿瘤的发生发展过程中具有决定性作用[2]。Bmi-1基因属于多梳基因家族，在维持肿瘤干细胞的增殖中的作用非常重要[3]。本项目旨在研究 Bmi-1基因在结肠癌干细胞SW480的表达，初步探讨其在成瘤过程中的作用和机制，希望能在结肠癌的治疗方面提供新的靶点，从而为从干细胞的层面上根治结肠癌提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 人结肠癌细胞株SW480购自中国科学院上海生命科学研究院细胞生物学研究所。高糖DMEM培养基、DMEM/F12培养基（invitrogen原装）购自杭州沃森生物技术有限公司。CD133/2（293C3）-PE鼠抗人抗体、CD133同型抗体（鼠IgG1-PE），购自德国美天旎公司，BD FACSCalibur流式细胞仪，美国BD公司。胎牛血清和TrypLE，购自美国Gibco公司；

1.2 结肠癌细胞株SW480的培养与分离 用含10%胎牛血清的高糖型DMEM培养基对人结肠癌细胞株SW480进行培养，置于5% CO2、温度37 ℃和饱和湿度的培养箱中培养，至细胞贴壁生长至80%～90%融合时，用0.02%EDTA混合液和0.25%胰蛋白酶进行消化传代，等到细胞处于对数期、有良好生长状态时用于实验。

用TrypLE将处于对数生长期的细胞进行消化后，将TrypLE去掉，添加适量的PBS液吹打成单细胞悬液。接种于50 mL细胞培养瓶进行培养，在细胞培养24 h之后，将培养瓶中的细胞悬液移入离心管中并分成CD133同型抗体组和CD133抗体组。将每组细胞以100×g离心5 min，弃上清。CD133同型抗体组加入100 μL的CD133同型抗体稀释液，CD133抗体组加入100 μL的CD133抗体稀释液，静置4 ℃冰箱，避光，孵育30 min。用200目筛网滤过标记好的细胞悬液，用流式细胞仪检测并分选CD133+和CD133-细胞群。

1.3 CD133+细胞肿瘤干细胞样生物学特性的鉴定

1.3.1 CD133+细胞体外成球能力检测 用干细胞培养基培养分选获得的CD133+和CD133-细胞亚群，对其体外连续成球能力进行观测。

1.3.2 CD133+细胞体外诱导转化实验 收集细胞球，离心（100×g，5 min），弃上清，加入DMEM基础培养基（5%胎牛血清、5%青霉素、5%链霉素）5 mL进行培养，对细胞生长情况进行观察。

1.3.3 CD133+细胞体外增殖能力的检测 用干细胞培养基将分选所得CD133+细胞组和CD133-细胞组配成单个细胞悬液，调细胞密度到1×107/L，随后接种细胞至96孔板中，200 μL为一孔，12个复孔为一组。置培养板在CO2培养箱中，在温度37℃、5% CO2条件下培养，每隔3天换液1次，分别用CCK-8比色法于第1、3、6、9、12、15天和18天时在酶标仪上测定每孔细胞的吸光度（A）值。步骤：每孔添加20 μL CCK-8溶液，继续培养4 h后，在酶标仪上，选择450 nm，测定每孔450 nm的A值，以空白组调零，将实验结果记录。横轴为生长天数，纵轴为每组所得数据的均值，绘制细胞的生长曲线，依此将两组细胞的增殖情况进行比较。

1.4 Real-time PCR检测CD133+和CD133-细胞亚群中Bmi-1基因的表达量 细胞总RNA的抽提根据Trizol裂解液说明书进行。RNA纯度及浓度的测定采用紫外分光光度仪。逆转录根据逆转录试剂盒说明进行。Real-time PCR反应采用Sybrgreen染料法、荧光实时PCR仪（Applied Biosystems公司）进行。内参照为β-actin。引物设计如下：5"-GCTGATGCTGCCAATGGCTCTAA-3"为Bmi-1上游引物，5"-TCATTCACCTCCTCCTTAGATTTC-3"为下游引物；5"-TGGCACCCAGCACAATGAA-3"β-actin为上游引物，5"-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3"为下游引物。PCR反应条件：95 ℃ 2 min预变性，之后每一步：变性95 ℃，30 s，退火延伸60 ℃，35 s，40个循环，检测。

1.5 统计学处理 采用SPSS 12.0统计学软件对所得数据进行分析，计量资料以（x±s）表示，两组间比较用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析（one-way ANOVA），多组间两两比较用LSD，以上实验均在同等条件下重复3次，最终结果取平均值，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SW480细胞中CD133+细胞和CD133-细胞的分选 通过流式细胞术富集SW480细胞中CD133+细胞，检测到CD133+细胞及CD133-细胞的百分比分别为7.02%及92.98%。

2.2 CD133+和CD133-成球能力及其诱导分化情况 立即用无血清干细胞培养液把分选后的CD133+和CD133-细胞进行培养，CD133+细胞培养1～2 d时，细胞悬浮生长，呈透亮、圆形；培养4 d后，细胞悬浮漂移，呈典型的球形生长，数量显著增多；伴随时间的推移，形成的肿瘤细胞球数量继续增加，体积增大，细胞密度增加。在干细胞培养基中，CD133-细胞不能形成细胞球。用TrypLE将悬浮细胞消化掉，离心洗涤，制成单细胞悬液，再用DMEM/F12培养基（含10%胎牛血清）进行培养，4 h后，细胞长成梭形状，部分贴壁生长；24 h后细胞完全贴壁生长。上述结果表明，细胞球在无血清培养基中获得后，可以在含血清的培养基中贴壁分化，能连续传代。

2.3 CD133+和CD133-细胞的增殖能力 置分选出来的CD133+细胞和CD133-细胞于无血清培养基中，并且添加生长因子，比较它们的体外增殖能力。由图1可见，从培养第3天开始，CD133+细胞增殖比较明显，CD133+细胞数在第3～6天增长最为迅速，其生长曲线从第6天开始直至培养第15天仍不断上升，从第15天到18天增长相对平缓，但整个生长周期内CD133+细胞数始终保持增长状态，提示在体外CD133+细胞增殖能力较强。CD133-细胞方面，从培养第1到第3天，细胞生长最为迅速，与CD133+比较，生长速度基本一致，但数量较少，差异有统计学意义（P<0.05）。第3天开始至第12天，生长曲线较为平坦，提示细胞数几乎没有增长，第12天之后，曲线开始呈下趋势降，细胞数量下降明显，提示CD133-细胞与CD133+细胞比较，其在体外增殖能力明显较弱。

2.4 RT-PCR检测Bmi-1 mRNA在CD133+和CD133-细胞的表达 RT-PCR检测结果显示，Bmi-1 mRNA在SW480结肠癌细胞株中CD133+细胞的表达显著高于CD133-细胞，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。

3 讨论

既往观点认为，肿瘤的每个细胞都具有形成克隆和无限增殖的能力，都是均一的，然而具体参与肿瘤的形成、复发的细胞却是随机的。通过对血液系统肿瘤的回顾性研究，Reya和Morrison等在2001年提出完整的肿瘤干细胞（Tumor/cancer Stem Cells，TSCs/CSCs）学说，认为肿瘤的主体是由无自我更新能力、具有一定分化特征的非干细胞样细胞构成，而具有极强的增殖潜力、维持肿瘤生长，且可能与肿瘤的转移、复发关系密切的具有干细胞特征的肿瘤细胞只占肿瘤的一小部分，被称为TSCs[4]。此后，研究发现，肿瘤干细胞不仅存在于血液系统，而且存在于多种实体瘤中，如前列腺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、脑肿瘤。肿瘤学领域具有划时代意义的全新理论之一就是肿瘤干细胞学说，其为肿瘤形成机制的研究带来新的思路，同时也为临床肿瘤的诊断和治疗带来了曙光和希望。现阶段鉴定肿瘤干细胞还不能从形态学上入手，而多采用功能学的方法，主要包括化疗抵抗、分化潜能、自我更新能力、裸鼠体内成瘤等几个主要生物学特征。肿瘤干细胞的分选方法主要包括：（1）利用侧群细胞（side population cells，SP）分选；（2）利用肿瘤干细胞表面特异性标志进行分选。Haraguchi等[5]在2006，年从多种人结肠癌细胞系中利用流式细胞术分离出少量SP细胞，认为SP细胞具有干细胞的特征，推测其为结肠癌干细胞。孙岚等[6]在2007年发现，CD133+细胞与CD133-细胞均从肝癌细胞系Huh-7细胞中分选出，两者相比，CD133+细胞在体外有较高增殖潜能。O’Brien等[7]在结肠癌细胞中发现了所占比例很小的细胞表面标记为CD133+的细胞，其增殖能力很强，经过连续移植传代后，仍能分裂增殖、分化，并能保持其异质性。而CD133-结肠癌细胞虽然占比例很大，但经移植后并不能够导致结肠癌的发生。通过他们的研究，可以推断出CD133+为结肠癌干细胞的细胞表面特异性标志。本研究也发现，结肠癌细胞系SW480细胞中，CD133+的细胞所占比例少于8%，而结肠癌细胞系SW480细胞中分选出的CD133+细胞与CD133-细胞相比，在体外的生长速度和增殖数量都有显著差异，表明CD133+细胞有较高增殖潜能。

Bmi-1（B-cell-specific moloney leukemia virus insert site 1）基因是一种原癌基因，属于多梳基因（Polycomb group，PcG）家族，1991年在鼠淋巴瘤细胞中被发现。PcG家族作为在果蝇发育时维持同源异形基因稳定表现的重要因子，在干细胞的维持、胚胎发育和肿瘤发生中有着不可忽视的作用[8-9]。目前，关于Bmi-1基因在维持正常干细胞“干性”作用的研究已在人体多种组织中得到证实[10-12]，而在肿瘤干细胞中的作用研究，多见于白血病干细胞、乳腺癌干细胞、喉癌干细胞和肝癌干细胞等[13-14]。Bmi-1基因对其他消化道肿瘤干细胞生物学特性的作用尚待进一步研究发现。结肠癌研究方面，已有研究发现Bmi-1在正常结直肠组织中几乎不表达，而在肿瘤组织中大量表达。贾雪峰等[15]研究发现Bmi-1基因表达与大肠癌浸润深度、淋巴结转移和TNM分期显著相关，与正常大肠组织比较，大肠癌组织Bmi-1基因表达阳性率显著升高，而Bmi-1基因表达阴性率明显降低，认为Bmi-1基因的高表达可能与大肠癌的发生和发展有紧密联系。本研究结果表明，结肠癌细胞株SW480中CD133+细胞的表达显著高于CD133-细胞。因此笔者推测结肠癌中Bmi-1基因的高表达可能与结肠癌干细胞有较强增殖潜力、维持肿瘤生长有关。

综上，以CD133为特异性表面标志是富集结肠癌干细胞的其中一种手段，尽管在结肠癌细胞株SW480中CD133+的细胞所占比例很小，但是其增殖能力很强。在CD133+细胞中，Bmi-1基因表达量显著高于其在CD133-细胞的表达中，这可能参与了结肠癌的发生与发展。

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（收稿日期：2014-10-12） （本文编辑：蔡元元）

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