高效液相色谱法在食品安全检测中的应用概况

【关键词】 高效液相色谱法；食品安全检测

文章编号：1003-1383(2007)03-0323-03

中图分类号：R 994.4文献标识码：B

食品贸易的全球化使广大消费者受益，大量高品质、价格合理、安全的食品应运而生，满足着广大消费者的需要。日趋加速的城市化状况导致食品的制作、运输、贮存、销售需求不断增加。同时还会有一些不法制假商贩制造或贩卖伪劣食品，甚至在食品中掺入有毒化学品，给消费者造成极大伤害，这就需要有一套完整的监测监督机制。作为降低食源性危害的有效手段，许多食品安全项目正越来越侧重于从农田到餐桌的整个过程，虽然国家在保证食品安全方面作大量的工作，每年仍有相当数量的消费者因进食受污染的食品而中毒、发病、乃至死亡。当今农产品、食品安全已成为世人十分关注的热门话题，食品安全监测面临着严峻挑战，因此，急需建立快速调查食源性疾病和监测食品污染的措施和方法。本文就高效液相色谱(HPLC)技术在食品安全检测方法中的应用概况作一综述。

食品不安全因素及HPLC应用范围

据报道，每年世界上发生的食品污染病例在7000万例以上。食源性疾病的爆发已引起媒体的广泛关注和消费者的关心。当前食品中的不安全因素主要表现在以下几个方面［2］：微生物、寄生虫等生物污染；环境污染；农用、兽用化学物质的残留；自然界存在的天然毒素；营养素不平衡；食品加工和贮藏过程中产生的毒素；食品添加剂的使用；食品掺伪；新开发的食品资源及新工艺产品；包装材料。食品中最常见的有毒有害物质是有机合成农药、兽药残留物及污染物和致病菌。

高效液相色谱法(HPLC)是上世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分析分离技术。它是由现代高压技术与传统的液相色谱方法相结合，加上高效柱填充物和高灵敏检测器所发展起来的新型分离分析技术，是以经典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理论与实践方法，流动相改为高压输送，采用高效固定相在线检测手段发展而成的分离分析方法，分离机制是靠被分离组分的分子与流动相分子争夺吸附表面活性中心的吸附能力差别而分离(可用吸附系数Ka衡量吸附能力的差异)，是现代分离分析的重要手段，随其分离检测技术的日益完善，已被广泛应用于各个学科中。由于它只要求样品能制成溶液，而不需要气化，因此不受样品挥发性的约束。对于挥发性低，热稳定性差，分子量大的高分子化合物以及离子型化合物尤为有利，如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、脂类、维生素、抗生素等分子量较大，沸点较高的合成药物以及无机盐类。所以说HPLC具有适用范围广、分离效率高、速度快、流动相可选择范围宽、灵敏度高、色谱柱可反复使用、流出组分容易收集、安全等优点。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定［1］。

HPLC对食品添加剂及农药的测定

苏丹（Sudan）色素是一种人工合成染料，在化工生产中主要用于对油类、蜡和肥皂的染色。有关研究表明，苏丹Ⅰ号（Sudan Ⅰ）会导致鼠类患癌，它对人类肝细胞也显现出可能致癌的特性。李军［3］等建立了食品中4种苏丹色素的高效液相色谱同时测定方法。采用乙腈提取后经凝胶渗透色谱法对样品进行净化，利用反相高效液相色谱法，以乙腈－酸性水溶液为流动相，采用梯度洗脱，以二极管阵列检测器定性定量测定食品中的4种苏丹色素，结果最低检出限分别为0.102、0.097、0.074、0.099 mg/kg。阿斯巴甜、糖精钠、乙酰磺胺酸钾等添加剂对人体有一定的毒害作用。特别是阿斯巴甜，它在体内代谢过程中的主要降解物为苯丙氨酸和天门冬氨酸，对于苯丙酮尿病(PKU)患者，因其代谢缺陷，体内过多的苯丙氨酸可影响患者的发育，所以有该病的患者要禁用添加阿斯巴甜的食品。刘思洁［4］等建立了一种可以同时测定饮料中糖精钠、乙酰磺胺酸钾、阿斯巴甜的方法，采用C18反向柱，以乙腈－0.02 mol/L硫酸铵溶液（5∶95）为流动相，在214 nm波长处检测。结果以上三种甜味添加剂在饮料中最低检出限为 4 μg/ml。目前蔬菜水果中不同种类农药的残留测定方法主要是气相色谱法(GC)或气相色谱 －质谱法 (GC－MS )，但GC对沸点高或热稳定性差的农药需进行衍生化处理，这样就不可避免地增加了样品前处理的难度，也使它的应用受到一定程度的限制。李永新［5］等建立了同时测定蔬菜水果12种农药残留的反相高效液相色谱分析方法。将样品捣碎，用乙酸乙酯超声提取，经Florisil固相萃取柱净化、正己烷－二氯甲烷( 1∶1)洗脱、氮气吹干、甲醇溶解并定容后，采用高效液相色谱柱分离、紫外检测，以外标法定量。结果表明：5种有机磷农药、6种拟除虫菊酯类农药和除草剂二甲戊乐灵的检测限为0.114－2.65 ng。应用该法对从市场上随机购买的莲白、小白菜、黄瓜等20个蔬菜样品和

作者简介：陆兴毅（1975-），男，广西田阳县人，主管药师，理学士。苹果、梨等20个水果样品进行检测，其中氧化乐果的检出率分别为55%和45%，辛硫磷的检出率分别为50%和30%，由此可见，国家明文规定的不得用于蔬菜、瓜果的剧毒、高毒农药仍有检出。

HPLC对食品中兽药残留物的测定

1.盐酸克仑特罗(俗称瘦肉精)系β2受体兴奋剂，禁止作为畜禽类生长促进剂使用。近年来，我国曾多次报道了因食用含有盐酸克仑特罗残留的猪肉及内脏等造成的中毒事件。陈金枝［6］等建立HPLC法测定猪眼 、猪肝 、猪肺中微量盐酸克仑特罗，样品经乙醚－丁醇提取，用Hypersil C18色谱柱，甲醇－0.01 moL/L磷酸二氢钾溶液为流动相。结果样品中盐酸克仑特罗最小检测量为0.20 ng。用该法对市场上猪眼、猪肝、猪肺等30份样品进行测定，结果在猪肺中的残留在检出限以下，猪眼、猪肝中最大残留分别为0.96、0.22 mg/kg。

2.磺胺类药物是抗感染药剂，具有杀菌作用，因此在饲料中常常被添加。但是，过量的药物残留会损害人体健康。郭根和［7］等采用反相高效液相色谱法，用C18色谱柱、紫外检测器，以5 mmol/L NaH2PO4溶液－乙腈溶液为流动相，测定虾中磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲氧基嘧啶、磺胺喹恶啉等5种磺胺类药物残留，结果最低检测限为2 μg/kg，符合痕量测定的要求。

3.薄海波［8］等采用柱切换直接进样高效液相色谱法测定蜂蜜中3种四环素类抗生素(土霉素OTC、四环素TC、金霉素CTC)的残留量，先用缓冲溶液溶解样品后，直接进样，以二次蒸馏水作流动相在C18预柱上在线富集和净化，然后用柱切换阀将预柱与一个C18分析柱接通，以草酸溶液－乙腈－甲醇作流动相，紫外检测器在350 nm处检测。结果各组分回收率大于86%，相对标准偏差小于8.0％，最低检出浓度为0.005 mg/kg，满足了日本等国对进口蜂王浆中土霉素、四环素、金霉素残留量（0.05 mg/kg)要求。

4.孔雀石绿、结晶紫属三芳基甲烷化学物质，长期以来许多国家曾将其作为水产养殖业的杀菌剂，可用于鱼类高发的水霉病、原虫病的控制，但是进一步研究证实，孔雀石绿等进入人类或动物机体后，通过生物转化可产生致癌、致畸、致突变等副作用，上世纪90年代以来许多国家都将其列为水产养殖的禁用药物。任秀莲［9］等研究水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐性孔雀石绿、隐性结晶紫的同时测定鱼、虾、蟹等可食部分上述化学物质的残留量，样品经离心提取后用PbO2－硅藻土柱为柱后氧化柱(35 mm×416 mm)，用乙腈－乙酸铵缓冲溶液－冰醋酸（58∶14∶28）为流动相，检测波长618 nm，通过将ODS柱分离与 PbO2柱后衍生联用，实现了4种物质的同时分离和测定。结果表明，石碟鱼、螃蟹、虾、刀鱼样品中孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫的残留量均小于2 μg/kg。

5.激素是由内分泌腺和散在其它器官的内分泌细胞所分泌的微量生物活性物质，动物和人体内正常时含量甚微，残留于动物性食品中的激素常为性激素，当性激素超过人体正常水平时，会破坏机体的正常生理平衡而呈现不良后果。因此对食品中激素残留的测定十分重要。王帆［10］等研究检测大豆异黄酮类保健食品中三种雌激素(雌二醇、雌酮、己烯雌酚)含量的分析法。采用Hypersil ODS2 Cl8色谱柱，流动相为甲醇－水(体积比53∶47)，流速 1.0 ml/min，检测波长280 nm，该方法的线性范围在 0.5－250 mg/L，三种雌激素的最低检出限分别为0.8、0.9、0.4 mg/L。

HPLC对食品加工贮藏过程产生毒素的分析

一些食品在加工过程中会产生化学变化，生成对人体有害的物质。2002年4月瑞典斯德哥尔摩大学Margareta Tornqvist教授，首次在油炸及焙烤的马铃薯和谷物类食品中发现了具有神经毒性的潜在致癌物——丙烯酰胺(Acrylamide)，该毒物很容易经消化道、皮肤、肌肉或其他途径吸收，并能通过胎盘屏障，是一种公认的神经毒素和准致癌物，已被WHO国际癌症研究中心(IRAC)列为可能致癌物质(ⅡA 类)。2005年4月13日我国卫生部发布了“建议全国消费者避免食用油炸薯片和油炸薯条”的公告，呼吁采取措施减少食品中丙烯酰胺可能导致对健康的危害。柳其芳［11］等检测食品中致癌物丙烯酰胺的固相萃取－二极管阵列检测－反相高效液相色谱测定，用水提取食品中丙烯酰胺，采用C18固相萃取小柱对样品液进行纯化，流动相为甲醇－水(体积比5∶95)，DAD扫描波长范围190－370 nm，检测波长210 nm。结果丙烯酰胺在0.1－10 mg/L 浓度范围内线性良好，方法检出限为10 ng/g。用建立的方法分析了59份面包、谷类、豆类、坚果类和土豆类食品，结果显示，食品炸焦的程度越深，则丙烯酰胺含量越高。食品贮藏不当，会引起真菌生长，造成食品的腐败变质，同时有些霉菌产生的霉菌毒素，具有较强的毒性和耐热性。黄曲霉毒素(AFT)是一种毒性极强的真菌毒素，目前已分离鉴定的有近20种，是一类化学结构相似的物质，其中以 B1、B2、G1、G2 和M1、M2为主。在天然污染的食品中以B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。林裕［12］建立HPLC测定食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量的方法，采用ALLSPHERE ODS （250×416 mm）色谱柱，流动相为乙腈/水（梯度洗脱），荧光检测器：激发波长360 nm，发射波长440 nm。结果最低检出的B1、B2、G1、G2分别为浓度0.20 μg/kg，0.05 μg/kg，0.20 μg/kg，0.05 μg/kg。样品进行净化、衍生处理后，用荧光检测器检测，检出的浓度比国标法［13］提高10倍。单端孢霉烯族化合物是镰刀菌属的霉菌和其它一些真菌产生的二次代谢产物，是引起人畜各种损害的天然有毒化合物，包括T－2毒素、HT－2毒素、NEO以及二乙酰镳草镰刀菌烯醇(DAS)四种毒素，具有着很强的致癌性，这类毒素紫外吸收强度极弱，用高效液相色谱分离－紫外检测器检测此类毒素，检测的灵敏度低，选择性差，许烨［14］等建立了高效液相色谱荧光检测器测定谷物中A－型单端孢霉烯族化合物的方法。样品经乙腈－水(84∶16)混合溶剂和二氯甲烷提取，通过FlorisilSep－Pak净化柱净化，以氧杂萘邻酮－3－羰酰氯为衍生化试剂、4－二甲基氨基吡啶(DMAP)为催化剂进行衍生，然后再通过液液萃取净化，以ZORBA XEclipse XDB－C18柱为分离柱，乙腈－水－0.75%醋酸(65∶35)为流动相，激发波长292 nm，发射波长425 nm进行高效液相色谱分离和检测。结果四种毒素的浓度在0.01－2.0 μg/ml范围内呈良好线性，检出限为0.01 μg/g。

高效液相色谱法在食品安全性检测和分析方面的应用范围很广，具有分离效率高、速度快、流动相可选择范围宽、灵敏度高、流出组分容易收集的优点，既可用于分离也可用于定量，更适用于各种各样的化合物。而且随着一些样品前处理新技术，如固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)、基质固相分散萃取(MSPDE)、超临界流体萃取(SFE)、凝胶渗析萃取(GPC) 技术相继出现并很快推广，以及计算机软件开发、专家系统应用、检测手段的进步及与质谱等仪器的联用等相关问题的解决，高效液相色谱法的应用也会越来越多，在食品安全检测中具有广泛的应用前景。

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