埃里格孢的生物学特性及致病性初步研究

材料与方法

1.1材料

从鳜鱼的鳃部分离到的菌株，在PDA培养基上纯培养，将纯培养的菌种保存于4 ℃冰箱备用。

1.2方法

1.2.1菌株的分离鉴定提取菌株DNA，扩增其18S rRNA基因。扩增使用的引物是通用引物NS1与NS6[2]，将菌株的18S rRNA基因序列输入GenBank数据库中，查找相似菌种。将真菌接种到PDA培养基上，25 ℃恒温培养 3～12 d，每天观察菌落形态与颜色。再在显微镜下观察其产孢结构，分生孢子梗着生情况，孢子形态、大小与颜色等。采用分子鉴定和形态鉴定方法与步骤，具体步骤见文献[3]。

1.2.2不同pH值对埃里格孢的影响供试pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的PDA平板，共7个处理，平行做3次。切取菌龄一致的菌饼（直径8 mm），将其置于平板中央，在28 ℃下恒温培养，观察并记录菌落的生长速率，培养24 h后采用十字交叉法测定菌落直径[4]，试验周期为7 d。

1.2.3不同温度对埃里格孢的影响供试温度为5、10、15、20、25、30、35、40 ℃共8个温度梯度，平行培养3次，切取菌龄一致的菌饼（直径8 mm），将其置于平板中央，在28 ℃下恒温培养，观察并记录菌落的生长速率，培养24 h后采用十字交叉法测定菌落直径，试验周期为7 d。

1.2.4埃里格孢的致病性用埃里格孢回复感染草鱼和鲤鱼，提前买一批供试鱼，等到供试鱼在自然条件下生长稳定，开始进行回复感染。将鱼分装到养鱼箱中，每箱数量为10尾，平行做3次，1箱对照组，2箱试验组。对照组不进行任何处理；试验组用浸泡法（在鱼的胸鳍处用小刀割1个3～5 cm长的小口，将PDA平板上生长的埃里格孢菌丝和分生孢子用刷子刷入养鱼箱中）和涂抹法（在鱼的胸鳍处用小刀割1个3～5 cm长的小口，用灭菌棉签沾取埃里格孢的分生孢子涂抹于伤口处）处理草鱼和鲤鱼，试验周期为15 d，观察埃里格孢的致病性。

2结果与分析

2.1埃里格孢的鉴定结果

将菌株的18S rRNA基因序列输入GenBank数据库中，经过用Blast工具比对，该菌株属于埃里格孢属。

经过形态观察，菌丝体表生至埋生；菌丝无色，具隔膜，壁光滑，宽2～4 μm。分生孢子梗直或弯曲，简单或具分枝，褐色至暗褐色，具隔膜，长达70 μm，宽6～8 μm，在上端产孢处屈膝状弯曲，具多个产孢孔，内壁芽生孔式产孢，合轴式延伸。产孢细胞单芽生至多芽生、合生，圆柱状，褐色。分生孢子淡褐色至褐色，单生，壁光滑，倒卵形、卵圆形、椭圆形或近圆柱形，直或形成各种弯曲，呈“乙”形或“S”形等，中间略粗、两端稍细，具多个横隔膜（通常3～6个），横隔膜加厚、色深，分隔处略隘缩，似桶箍状。偶有纵隔膜或斜隔膜，孢子脱落痕明显，（30～40） μm×（10～12） μm，可形成次生分生孢子梗（图1-a）。

分生孢子在水中，25 ℃时4 h左右即可萌发，主要从两端细胞萌发，也可从中间细胞萌发，萌发芽管生长迅速，48 h左右萌发的芽管即可分化形成菌丝或次生分生孢子梗，从上产

生次生分生孢子。次生分生孢子可继续萌发产生细的芽管，其表面常生细小的疣突。萌发的分生孢子细胞可产生1至数个芽管，分生孢子梗亦可萌发产生芽管，多数再很快转变成次生分生孢子梗（图1-b）。

依据形态学特征，结合分子鉴定结果，初步鉴定为丝孢纲（Hyphomycetes）丝孢目（Moniliales）埃里格孢属（Embellisia）埃里格孢（Embellisia allii）[5]。

2.2不同pH值对埃里格孢生长速率的影响

在不同pH值条件下培养，观察pH值对埃里格孢生长的影响。由图2和表1可见，埃里格孢在pH值为5.0～11.0均能生长，差异极显著（P<0.01）（SPSS软件的单样本t检验），表明pH值对埃里格孢的生长影响非常明显。由表1可见，pH值为9.0、10.0和11.0时，菌丝生长速率相对较快，分别为34.45、36.38、36.56 mm/d。

2.3不同温度对埃里格孢的影响

在不同温度条件下培养，观察温度对埃里格孢生长的影响。由表2、图3可见，在5～20 ℃温度范围内，菌丝生长速度随温度升高而增大；在20～35 ℃温度范围内，菌丝生长速率随温度升高而减慢。用SPSS软件的进行单样本t检验，差异极显著（P<0.01），表明温度对埃里格孢的生长影响非常明显。25 ℃和30 ℃生长速率相差不大，菌斑分别达30.74 mm/d和30.57 mm/d，20 ℃生长最快，达38.83 mm/d，可视为最适温度。

2.4埃里格孢的致病性

用浸泡法和涂抹法回复感染草鱼和鲤鱼，15 d之后，试验组的鱼身上没有发现明显的感染症状。

取材进行再培养，没有发现埃里格孢，初步判断埃里格孢对草鱼和鲤鱼无感染能力，单一菌株的埃里格孢可能对淡水鱼无致病性。

3讨论

对从患病鳜鱼身上分离的埃里格孢进行生物学特性的初步研究，将菌株接种到不同pH值的PDA培养基上，于温度25 ℃恒温培养，发现pH值为9.0～11.0时，埃里格孢的生长速率较快（表1）。将菌株接种到PDA培养基上，在不同温度下恒温培养，在温度5～20 ℃范围内，菌丝生长速率随温度升高而增大；温度20～35 ℃内，菌丝生长速率随温度升高而减小，差异极显著；25 ℃和30 ℃生长速度相差不大，20 ℃时埃里格孢生长最快，40 ℃时菌丝几乎不生长（表2）。

陈伟群等报道埃里格孢寄生于大蒜鳞茎，引起黑褐色病斑，后期病斑凹陷失水干燥，表面密生黑色霉层[5]，但该菌是否致病于动物还未查到相关报道。本试验是针对从鳜鱼鳃部分离的埃里格孢通过不同温度和不同pH值对它的生长影响来进行生物学特性初步研究后，再以草鱼和鲤鱼为感染对象，用该菌进行回复感染，对其致病性作初步研究，试验结果表明，15 d之后，试验组的鱼身上没有发现真菌埃里格孢，所以埃里格孢对草鱼和鲤鱼可能没有致病性。

据张月星等报道，常见的真菌性鱼病有水霉病、鳃霉病2种[6]。鱼在换水或搬运时体表受伤，局部皮肤坏死，水霉菌便乘机入侵，主要症状为病变部位长着大量棉絮状的菌丝，像一团团的毛，鱼体由于负担过重，游动失常，食欲减退，甚至会瘦弱而死。鳃霉病主要症状为病鱼鳃部呈苍白色，有时有点状充血或出血现象，此病常出现暴发性急剧死亡。埃里格孢单独回复感染草鱼和鲤鱼可能不病致，但与其他真菌一起能否引起鱼类致病还有待进一步研究。

综上所述，该株埃里格孢是从患病鳜鱼的鳃部分离到的，对其进行生物学特性及致病性初步研究，可以了解该真菌是否对淡水鱼具有致病性，在什么条件下会致病，从而为养殖鱼类的真菌性疾病防治提供理论依据，具有很重要的理论意义和适用价值。

参考文献：

[1]张天宇. 中国真菌志：第31卷暗色砖格分生孢子真菌26属[M]. 北京：科学出版社，2009：60-62.

[2]周小玲，沈微，饶志明，等. 一种快速提取真菌染色体DNA的方法[J]. 微生物学通报，2004，31（4）：89-92.

[3]魏福伦，朱里鹏，王庆容. 3株鲈鱼体表可疑性致病真菌的分离鉴定与生物学特性[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：187-190.

[4]董国菊，申晚霞. 重庆地区玉米圆斑病菌生物学特性的测定[J]. 西南大学学报：自然科学版，2010，32（12）：8-13.

[5]陈伟群，张天宇. 中国一新纪录属——埃里格孢属（Embellisia）[J]. 真菌学报，1996，15（2）：152-153.

[6]张月星. 观赏鱼真菌性疾病和寄生虫病的中草药治疗[J]. 水产科技情报，2002（4）：187-188.刘思思，高旋旋，胡竹青，等. 镉诱导锦鲤肾脏氧化性DNA损伤及谷胱甘肽抗氧化系统改变[J]. 江苏农业科学，2016，44（2）：272-274.

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