马尔尼菲青霉菌、组织胞浆菌及黑热病利杜体的鉴别诊断

【中图分类号】R512.91【文献标识码】B【文章编号】1672-3783（2013）12-0044-01

播散型马尔尼菲青霉病、组织胞浆菌病及黑热病常见于免疫力低下的人群。初期大多患者都有发热，贫血，浅表淋巴结、肝、脾肿大等相似的临床表现及骨髓涂片镜检下相似的病原体形态造成了认识上的混淆。近年来，随着艾滋病患者的增多，播散性马内菲青霉病发病率逐渐升高。因此，临床上应加强马尔尼菲青霉菌、荚膜组织胞浆菌及黑热病利杜体的鉴别诊断。

1一般特性

1.1马内菲青霉（penicillium marneffei，P.mar）为双相性真菌。1956年从越南竹鼠的肝脏中分离得到，1973年首次从一霍奇金病患者的肝脏中找到。P.mar在人体抵抗力低下时，通过呼吸道进入人体引起肺部感染，可侵犯人的网状内皮系统，患者主要表现为发热、贫血、咳嗽、浅表淋巴结肿大、肝脾肿大、全身多发性脓肿等。马内菲青霉病（penicilliosis marneffei）在世界各地均有报道，但以东南亚发病最多，如泰国北部、中国的广西、香港等地区。随着艾滋病的出现，本病越来越常见，已成为泰国北部艾滋病患者的第三种最常见机会菌感染[1]。

1.2荚膜组织胞浆菌（histlplasma capsulatum，H.cap）为双相性真菌。自然栖息地为富含鸟粪和蝙蝠粪的土壤中，可经呼吸道传染人类。分布于全世界，但最集中于美洲，在北美、中美和南美更为多见，在我国南方地区散在发病。组织胞浆菌病（histlplasmosis）的病原体有两种，一是荚膜组织胞浆菌，又称美洲组织胞浆菌，由此引起的疾病泛指组织胞浆菌病。二是荚膜组织胞浆菌的杜波变种（histoplasma capsulatum var.duboisii），又称为非洲型荚膜组织胞浆菌[2]。此菌主要侵犯网状内皮系统，有时也可由血行播散而侵犯全身，患者主要表现为发热、寒战、头痛、肌痛、咳嗽和胸痛等。

1.3利杜体（LD body）是引起黑热病（kala azar）的杜氏利氏曼原虫（leihmania donovania）在人体内的阶段，亦称无鞭毛体。黑热病曾是严重危害我国人民健康的五大寄生虫病之一，流行于长江以北16省、市、自治区的广大农村。主要通过白蛉为传播媒介，寄生在人体脾、肝、骨髓、淋巴结和肠黏膜系的网状内皮细胞内[3]。患者多现为长期发热，肝、脾、淋巴结肿大，贫血，消瘦等。

2生物学特性

2.1骨髓（血涂片、组织切片）瑞氏-姬姆萨染色镜检。

2.1.1马内菲青霉：可见细胞内、外有大量圆形或卵圆形的孢子，2～4μm大小，有时可见两头钝圆、中间有隔、直径3～5μm大小的腊肠形孢子[4]。

2.1.2组织胞浆菌：可见2～4μm大小的卵圆形、芽生、有荚膜的孢子，一端较尖，一端较圆，周围有一个似荚膜的亮圈，通常在大单核或多形核细胞内，有时在组织细胞外，多聚集成群[4]。

2.1.3黑热病利杜体：巨噬细胞内外可见大量2.9～5.7μm×1.8～4.0μm，圆形或椭圆形利杜体，胞质淡蓝色，胞膜薄，核一个，较大，圆形团块状，染紫红色，位于虫体的一侧。另一侧有一细小棒状紫红色动基体，还可见细胞前端颗粒状的基体和一单根丝体[2]。

2.2骨髓（血涂片、组织切片）糖原染色（PAS）镜检

2.2.1马内菲青霉：多位于吞噬细胞内，少数分布于细胞外，呈类圆形、长圆形或腊肠状，大小不一，约为2～8μm，胞壁染红色且清楚连续，在腊肠状的细胞内可见一明显的横隔，胞内容物不易着色。

2.2.2组织胞浆菌：多位于吞噬细胞内，少数分布于细胞外，呈类圆形或长圆形，大小较一致，约为2～5μm，胞壁染红色且清楚连续，胞内容物不易着色。

2.2.3黑热病利杜体：多位于吞噬细胞内，少数分布于细胞外，呈类圆形、长圆形，少数似短腊肠状，大小不一，约为2～6μm，胞壁不着色或着色浅或颗粒状而不连续，胞内容物染红色，较胞膜着色深而清楚[5]。

3培养特性

3.1马内菲青霉

3.1.1菌落特征：在沙堡弱（SDA）培养基上25℃培养为青霉相，约3～4天开始生长。菌落最初呈浅灰褐色膜样或淡黄色绒毛状，中央气生菌丝呈白色绒毛状，向周围扩展，逐渐形成淡灰褐色微带淡红色绒毛状。2周后变成棕红色蜡样，皱褶，并有白色绒毛样气生菌丝，菌落周围培养基、背面产生红葡萄酒色素并扩散到整个培养基。在马铃薯葡萄糖琼脂基上，菌落生长较快，2天后开始生长，初为浅黄白色绒毛装，以后变成淡青黄色，微红灰青色，亦可产生玫瑰红色素并逐渐扩散到整个培养基。37℃培养为酵母相，在上述培养基上菌落生长非常缓慢，呈酵母样型，膜状，有脑回样被褶，淡灰褐色或奶酪色，湿润。

3.1.2显微镜特征：25℃青霉相可见无色透明分隔菌丝，分生孢子梗光滑而无顶囊，帚状枝双轮生，散在，稍不对称，有2～7个散开，不平行的梗基，其上有2～6个瓶梗，顶端狭窄，可见单瓶梗，其顶端有单链分生孢子，散乱。分生孢子初为椭圆形，后呈圆形，光滑，可见孢间联体。37℃酵母相可见圆形、椭圆形、长形酵母样菌体，可见关节孢子。

3.2组织胞浆菌

3.2.1菌落特征：25℃ SDA初代培养，生长缓慢，初为白色至棕色，继代培养常为白色。血琼脂37℃培养可转变为酵母相，可分解尿素，但不能液化明胶。

3.2.2显微镜特征：25℃SDA培养，可以发现特征性的大分生孢子，但初代培养常不典型，继代培养可有典型大分生孢子，直径8～14μm，表面有指状突起。有的菌株产生椭圆形小分生孢子，2～4μm直径，生于从菌丝生出呈锐角的小梗上，有时可以出芽似哑铃状。37℃酵母相的形态与直接镜检相同。

3.3黑热病利杜体：原虫数太少时可作培养（NNN培养基）[1]。

4组织病理学特征

4.1马内菲青霉：在单核巨噬细胞系统之外的组织中常引起化脓性反应；在单核巨噬细胞系统器官为肉芽肿反应。在组织细胞内或散在组织细胞周围见到马内菲青霉。在细胞内菌体相互粘集呈桑葚状或葡萄状外观，呈卵圆形、椭圆形，其大小形状一致，直径约2μm。而游离于组织细胞外的菌则具有多形性，大小形态差异大，直径1～8μm不等，其中最特殊而具有诊断意义的为长形、粗细均匀、两头钝圆的腊肠状细胞，或呈杆状或弯曲呈弧形，横径与长径之比多为1∶3或1∶4，且常有横隔将其分为两段。

4.2组织胞浆菌：本菌侵犯的各个器官，其病理改变基本一致，开始为中央部分增生，吞噬细胞内有或多或少的真菌，其后组织坏死，周围呈肉芽肿样改变，最后则愈合而纤维化。在急性病例中，组织细胞中有无数孢子；在非急性病例中孢子数目较少，出芽也少，且大小不一致[1]。

4.3黑热病利杜体：患者可经淋巴结、肝、脾、皮肤损伤处穿刺涂片、活检，在类上皮细胞或巨噬细胞内可找到利杜体。利杜体在淋巴结中消失最慢易成为复发病灶，对淋巴结穿刺涂片可用于检查治疗后复发的患者[2]。

5免疫学试验

5.1马内菲青霉

5.1.1抗体检测：人类在感染马内菲青霉后，血中含有一定量的抗体。人体抗马内菲青霉免疫主要为细胞免疫，T细胞在组织中的出现有助于杀来真菌及局限病变，体液免疫特别是特异性抗体可促进细胞免疫功能，因此，检查细胞免疫功能指标可协助对该病的预后判断。

5.1.2抗原检测：用荧光素标记纯化的兔超免疫球蛋白G，通过ELISA定量检测患者尿中马内菲青霉抗原，为AIDS患者提供了有价值的快速诊断本病的方法，并可作为该病流行地的常规诊断方法。Mpl基因编码马内菲青霉特异的胞壁甘露蛋白Mplp，如同时检测Mplp抗原和抗Mplp抗体，成为血清学诊断现症的潜伏以及监测治疗的有效方法。

5.2组织胞浆菌

5.2.1抗体检测：以组织胞浆菌素作抗原的免疫扩散（ID）和补体结合试验（CF），在80%的患者可为阳性，在免疫抑制的患者可产生假阴性。对该病患者CF试验比ID试验更敏感，仅有1%的CF阴性患者ID呈阳性反应。如在连续标本中CF滴度大于1∶32提示活跃的感染。ID的敏感性虽比CF差，但其特异性比CF高。使用组织胞浆菌素作抗原，可检测到两条沉淀带，H带在活动的感染中很特异，但仅发生在10～25%患者。M带在85%以上的活动感染的病人可检测到，但在既往感染过或最近刚作过组织胞浆菌素试验的患者也可检测到。因为H和M带对组织胞浆菌病是特异的，所以ID为那些CF血清试验滴度低或出现交叉反应者提供了一个更特异的血清学诊断方法。

5.2.2抗原检测：是伴有AIDS的播散性组织胞浆菌病的最有效的血清学诊断方法。95%尿标本可检测到荚膜组织胞浆菌抗原，CSF和支气管灌洗液中也可检测到。

5.2.3组织胞浆菌素皮肤试验：常用1∶100～1∶1000的稀释液0.1ml作皮内注射。皮试不推荐做诊断试验[1]。

5.3黑热病利杜体

5.3.1抗体检测：一般采取利什曼原虫前鞭毛体作为抗原，可用酶联免疫吸附试验（ELISA）、斑点-ELISA、间接荧光抗体试验（IFAT）、间接血凝试验（IHA）、直接凝集试验（DA）、对流免疫电泳（CIEP）等检测，均具有较高敏感性和特异性。

5.3.2抗原检测：可作单克隆抗体-抗原斑点试验（McAb-AST），亦可作斑点-ELISA直接法与间接法试验，均具有较高敏感性和特异性。

5.3.3皮内试验：病人治愈后由阴性转阳性，故不适用于临床，在流行病学调查中有一定价值[3]。

6小结

随着艾滋病患者及旅游人员的增多，马内菲青霉病、组织胞浆菌病及黑热病的发生均呈上升趋势。临床检验工作人员在有疑似病例时应按照其临床表现及实验室检测加以区分。PAS染色、培养、血清抗原抗体检测均可区分马内菲青霉菌、组织胞浆菌及黑热病利杜体。

参考文献

[1]王端礼等.医学真菌学—实验室检验指南.北京：人民卫生出版社，2005.4：390-403

[2]税国顺，何代莉，毛翠.马尔尼菲青霉菌、荚膜组织胞浆菌和黑热病杜利小体的实验诊断与鉴别.中国基层医药，2005.4：499-500

[3]陈灏珠等.实用内科学.北京：人民卫生出版社，2001：626-629

[4]陈东科等.实用临床微生物学检验与图谱.北京：人民卫生出版社，2011.1：600-607

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