en橙皮甙对H2O2诱导大鼠心肌细胞凋亡的影响

【摘要】 目的 研究橙皮甙对H2O2诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法 培养并鉴定SD乳鼠心肌细胞;用H2O2诱导培养的大鼠心肌细胞凋亡,观察不同浓度橙皮甙(10-8 mmol/L、10-5 mmol/L、10-3 mmol/L)对SD乳鼠心肌细胞作用4、8、12 h后,用Tunel法检测心肌细胞凋亡。结果 橙皮甙组与模型组比较有抑制SD乳鼠心肌细胞凋亡的作用,且效应随橙皮甙浓度的增加和时间的延长而增强(P<0.01)。结论 橙皮甙对H2O2诱导的心肌细胞凋亡有抗凋亡保护心肌细胞的作用。

【关键词】 心肌细胞凋亡;橙皮甙;过氧化氢

柑橘类水果中重要的黄酮类化合物-橙皮甙具有清除羟自由基、体外抗LDL氧化修饰、减轻试验性家兔动脉粥样病变等作用[1-3],橙皮甙对损害的心肌细胞是否有保护作用是我们感兴趣的问题。本文采用胰蛋白酶消化法分离SD乳鼠心肌细胞进行体外培养,并用H2O2诱导的心肌细胞凋亡,制造心肌细胞凋亡模型,观察低、中、高不同浓度橙皮甙剂量组对H2O2诱导的心肌细胞凋亡的影响,从细胞水平研究橙皮甙抗氧自由基损伤的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 出生1~3 d SD乳鼠(雌雄不限),第三军医大学实验动物中心提供。

1.2 药品及试剂 小牛血清(杭州四季青生物公司),DMEM培养基、二甲基亚砜、30%H2O2、橙皮甙(Sigma公司),胰蛋白酶(华美生物工程公司),Tunel试剂盒(Rocho公司),AnnexinV-FITC试剂盒(南京凯基生物技术公司),二氨基联苯胺(DAB)、TritonX-100(北京中杉生物技术公司)。

1.3 心肌细胞分离、培养 取出生后 1~3 dSD 乳鼠心脏于 PBS 液中漂洗干净,将心室肌剪成 1~3 mm3小组织块,移入离心管,加入 0.125%胰蛋白酶于 37 ℃恒温摇床中消化20 min。弃上清,再用0.125%胰蛋白酶重复消化20 min后,收集上清液,立即加入含20%小牛血清的 DMEM 终止消化,同样的方法重复消化2~3次至心肌组织基本消化完为止。将收集的上清液用200目不锈钢筛过滤后移入离心管中,1000 r/min离心5 min,细胞沉淀用含20%小牛血清的 DMEM液悬浮。通过差速贴壁的方法去除成纤维细胞。收集所有心肌细胞接种于培养板中,置5%CO2、37℃细胞培养箱中培养 1.5 h 后,将未贴壁的心肌细胞吸出,用含 20%小牛血清的 DMEM 悬浮,计数。按实验目的调节细胞密度接种培养。

1.4 免疫细胞化学方法鉴定心肌细胞 将心肌细胞接种于 6 孔板中(0.1~0.5×105 个/mL)制备细胞爬片,培养2 d后用4%的中性甲醛固定,采用鼠抗人desmin抗体(一种鼠抗人的结蛋白,主要标记平滑肌和横纹肌)对培养的心肌细胞进行鉴定,同时确定心肌细胞的纯度。

1.5 MTT法筛选药物毒性 心肌细胞于96孔板中培养48 h,分为对照组、溶媒对照组、终末浓度分别为10-3 mmol/L、10-4 mmol/L、10-5 mmol/L、10-6 mmol/L、10-7 mmol/L、10-8 mmol/L的橙皮甙各组,橙皮甙各组溶媒(DMSO)的终末浓度均为0.5%。用酶标仪测定各组标本的光吸收值。

1.6 Tunel法检测心肌细胞凋亡 制备细胞爬片,分别以低(终末浓度10-8 mmol/L)、中(终末浓度10-5 mmol/L)、高(终末浓度10-3 mmol/L)不同浓度的橙皮甙剂量组与终末浓度为4.41 mmol/L的H2O2同时作用于心肌细胞,同时设立对照组、溶媒对照组、模型组,并于4、8、12 h分别用Tunel法检测各组细胞凋亡情况,每样品计数5个视野,按公式计算凋亡指数(AI):AI=凋亡细胞/(凋亡细胞+正常细胞)[4]。

1.7 统计学方法 结果以x±s表示,采用单因素方差分析,P<0.05表示有统计学差异。

2 结果

2.1 原代SD乳鼠心肌细胞培养及鉴定 原代乳鼠心肌细胞培养18~32 h后细胞贴壁生长,初为圆形,后为梭形或多角形,生出伪足,细胞致密、高度折光、胞质有颗粒样物质,胞核小,椭圆形颜色深,常有核仁1~2个,培养48 h的细胞单层融合并可见自发搏动,3~4 d细胞伸出的伪足可相互交织成网,从而形成一簇一簇的呈同步搏动的细胞团。用免疫细胞化学方法对心肌细胞进行鉴定。凡细胞浆经DAB染成棕黄色而胞核经苏木素复染呈淡蓝色均为心肌细胞(见图1),所培养细胞染色阳性率为95%以上,说明心肌细胞纯度达95%,可满足本实验需要。

2.2 MTT法筛选药物毒性 经MTT法检测不同浓度的橙皮甙对心肌细胞的作用,结果如下表所示,对照组、溶媒对照组及不同浓度的橙皮甙作用组在细胞毒性检测上未见明显差异。

2.3 Tunel法检测心肌细胞凋亡 对照组(图2)可见细胞核大,轮廓清晰,胞核经DAB染为棕黄色的凋亡细胞数量极少,绝大部分为经苏木素复染,胞核紫兰色的正常心肌细胞,任选10个高倍视野计算凋亡指数仅3%,而终末浓度为4.41 mmol/L的H2O2诱导心肌细胞4 h(图3)后,凋亡指数即达40%,凋亡心肌细胞胞核染为棕黄色,胞核固缩明显,胞核轮廓模糊不清(红箭头所示)与呈紫蓝色、胞核轮廓清晰的正常心肌细胞(蓝箭头所示)对比明显。诱导8 h后,凋亡指数达60%,而诱导12 h后,凋亡指数高达90%以上。用不同浓度橙皮甙在不同时段干预后,结果显示与模型组比较有统计学差异(P<0.01,表2),但橙皮甙的量效关系及时效关系尚未显示有明显的规律。

表1

MTT法检测不同浓度的橙皮甙对心肌细胞的作用

组别橙皮甙的浓度(mmol/L)MTT(A值,x±s,n=5)

A(对照组)—0.958±0.334

B(溶媒对照组)—0.724±0.291

C10-3 mmol/L0.795±0.335

D10-4 mmol/L0.732±0.380

E10-5 mmol/L0.826±0.448

F10-6 mmol/L0.927±0.286

G10-7 mmol/L0.756±0.241

H10-8 mmol/L0.837±0.324

表2

不同浓度橙皮甙对H2O2诱导心肌细胞凋亡的影响(x±s,n=5)

组别4 h8 h12 h

对照组0.03±0.0160.03±0.0110.03±0.014

溶媒组0.03±0.0170.03±0.0120.03±0.017

H2O2组(模型组)0.40±0.029*0.60±0.022*0.90±0.223*

橙皮甙高剂量组(10-3 mmol/L)+ H2O20.04±0.010#0.07±0.025#△0.09±0.020#△

橙皮甙中剂量组(10-5 mmol/L)+ H2O20.04±0.010#0.03±0.013#0.02±0.008#

橙皮甙低剂量组(10-8 mmol/L)+ H2O20.04±0.008#0.02±0.010#0.26±0.065#*

注:与模型组比较,#:P<0.01,与对照组比较,*:P<0.01,△:P<0.05

图1 心肌细胞免疫组化染色×400

图2 对照组×400

图3 H2O2 作用4 h组×400

3 讨论

活性氧自由基是心脏疾病发生及诱导心肌细胞死亡的主要因素之一,H2O2是体内氧化还原代谢的中间产物,同时又是一种ROS,当它在体内积累到一定程度可对机体细胞产生损伤作用。目前已有实验证明H2O2可以诱导心肌细胞凋亡[5]。本实验用MTT法对橙皮甙在10-8~10-4 mmol/L的浓度范围内进行药物毒性筛选,结果表明在该浓度范围内橙皮甙对培养的心肌细胞无毒性作用,用终末浓度为4.41 mmol/L的H2O2诱导心肌细胞凋亡,凋亡指数(AI)与H2O2诱导时间呈依赖关系。在建立H2O2诱导心肌细胞凋亡模型的基础上,分别加入低(10-8 mmol/L)、中(10-5 mmol/L)、高(10-3 mmol/L)不同浓度的橙皮甙作用,经用Tunel法检测细胞凋亡情况,结果显示与模型组比较有统计学差异(P<0.01),提示在设立的浓度范围内,橙皮甙对H2O2诱导的心肌细胞凋亡有拮抗作用,但这种作用是通过消除氧自由基的产生,还是通过其它机制减轻H2O2对心肌细胞的损害,还有待进一步的探索。本实验中橙皮甙的量效关系及时效关系尚未显示有明显规律,推测可能与橙皮甙作用浓度的选择或作用时间不够理想有关,还需进一步研究。

参 考 文 献

[1] 娄桂予,江渝,彭家和,等.橙皮甙抗LDL氧化及对MCP21mRNA转录的影响.第三军医大学学报,2004 ,26(8):717-719.

[2] 娄桂予,钱民章.橙皮甙、芦丁抗家兔动脉粥样硬化及对单核细胞趋化蛋白1mRNA表达的影响.中国动脉硬化杂志(会议专辑),2002,10(39):1-4.

[3] 秦得安,苏丹,王晓玲,等.橙皮苷对羟自由基的清除作用.中国药学杂志,1996,31(7):396-398.

[4] Zhang CY,Qu Sp,Hu GB.A modified method of flurescent staining for the apoptosis detection from blood tumor cells.Cancer Res Prev Treat,1998,5(6):432-436.

[5] Mohammad NS,KirstenM,Odd B.Effect of hydrogen peroxide on reocygenation-induced Ca2+ accumulation in rat cardiomyocytes.Free Radi.B iol &M ed,2004,37(4):531-538.

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