毓麟珠对早发性卵巢功能不全模型小鼠卵巢形态、卵泡发育及mTOR信号通路的影响

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摘要：目的  觀察毓麟珠对早发性卵巢功能不全（POI）小鼠卵巢功能、卵泡发育及mTOR通路的影响，探讨其作用机制。方法  以小鼠透明带3（Zp3）为抗原，皮下多点注射BALB/c雌性小鼠建立免疫性POI模型。实验分为空白组、模型组、阳性药组和毓麟珠低、中、高剂量，各给药组给予相应药物。HE染色观察小鼠卵巢形态及卵泡，ELISA检测小鼠血清激素水平，Western blot检测卵巢组织AKT、mTOR的蛋白表达，PCR检测mTOR下游相关Rheb、S6k1、4E-BP1的mRNA表达。结果  与空白组比较，模型组小鼠卵巢明显缩小，卵泡数量明显减少，血清促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）明显升高，抗苗勒氏管激素（AMH）、雌二醇（E₂）明显下降，Rheb、S6k1、4E-BP1 mRNA和AKT、mTOR蛋白相对表达量明显降低（P<0.05，P<0.01）;与模型组比较，各给药组小鼠卵巢增大，卵泡数量增加，血清FSH、LH均下降，AMH、E₂均升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;小鼠卵巢mTOR蛋白表达及其下游相关Rheb、S6k1、4E-BP1 mRNA表达均升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结论  毓麟珠治疗POI机制可能与调节mTOR信号通路相关因子基因和蛋白表达水平有关，通过促进卵泡发育，改善卵巢功能。

关键词：毓麟珠;早发性卵巢功能不全;卵泡发育;mTOR;小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.012

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2018）10-0049-05

Effects of Yulin Pills on Ovarian Morphology， Follicle Development and mTOR Signaling Pathway of Mice with Primary Ovarian Insufficiency

DONG Xiao-ying¹， FENG Xun-xun²， ZHENG Xiu-rui²， CUI Shuo²， ZHOU Wen-yuan²， CAO Wan-ning²

1. School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China; 2. School of Basic Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China

Abstract： Objective To observe the effects of Yulin Pills on ovarian morphology， follicle development and mTOR signaling pathway of mice with primary ovarian insufficiency （POI）; To discuss its mechanism of action. Methods Using mouse zona pellucida 3 （Zp3） as an antigen， BALB/c female mice were injected subcutaneously to establish immunological POI models. Mice were divided into blank group， model group， positive medicine group， and Yulin Pills low-， medium-， and high-dose groups. Each administration group was given relevant medicine. The ovarian morphology and follicles of mice were observed by HE staining， and serum hormone levels were measured by ELISA. Protein expressions of mTOR and AKT in mice ovarian were detected by Western blot. Expressions of Rheb， S6k1 and 4E-BP1 mRNA in mice ovarian were detected by PCR. Results Compared with the blank group， the ovary was significantly reduced and the number of follicles decreased significantly in the model group; FSH and LH increased significantly; AMH and E₂ decreased significantly; The relative expressions of Rheb， S6k1， 4E-BP1 mRNA and AKT， mTOR protein were significantly reduced （P<0.05， P<0.01）. Compared with the model group， ovaries increased， follicles increased， serum FSH and LH decreased， and AMH and E₂ increased in administration groups， with statistical significance （P<0.05， P<0.01）. The protein expression of mTOR and the expressions of downstream Rheb， S6k1， and 4E-BP1 mRNA in ovary increased， with statistical significance （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Yulin Pills has therapeutic effects on POI， and itsmechanism may be related to the regulation of mTOR signaling pathway-related factor genes and protein expression levels， which can improve ovarian function to promote follicular development.

Keywords： Yulin Pills; primary ovarian insufficiency; follicular; mTOR; mice

早发性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency，POI）是指卵巢功能不全所导致的40岁之前卵巢活动衰退的临床综合征。特点是月经紊乱伴随血促性腺激素浓度升高和雌激素浓度降低，包含卵巢内卵泡功能障碍或原始卵泡耗竭两个过程^[1]。POI屬卵巢早衰（POF）的前期，相对于POF在治疗上有更多逆转的空间。近年来，POI因其发病率逐渐增高引起了广泛关注。目前，西医治疗该病以激素替代为主，但不能有效促进卵泡发育^[2]，而中药治疗卵巢功能下降在临床取得了较好的疗效^[3]。

相关研究发现，mTOR通路与卵泡的生长、发育及增殖有关^[4]。其中mTORC1通过磷酸化下游靶蛋白激酶，介导细胞质量控制和蛋白质合成。mTORC2通过磷酸化蛋白激酶，进而参与细胞的存活与增殖，因此，mTOR通路为促存活通路。本实验建立免疫性POI小鼠动物模型，选择补肾育卵古方毓麟珠（《景岳全书·妇人规》），观察其对免疫性POI模型小鼠卵巢形态、卵泡发育及mTOR信号通路的影响，探讨其防治小鼠POI作用的分子机制。

1  实验材料

1.1  动物

SPF级BABL/c雌性小鼠60只，7～8周龄，体质量18～22 g，北京维通利达实验动物中心，动物合格证号SCXK（京）2012-0001。饲养于首都医科大学科研楼屏障动物房，自由摄食饮水，适应性喂养1周，观察动情周期。

1.2  药物及制备

毓麟珠（当归12 g，熟地黄12 g，菟丝子12 g人参6 g，麸炒白术6 g，茯苓6 g，白芍6 g，杜仲6 g，鹿角霜6 g，花椒6 g，川芎3 g，炙甘草3 g），饮片购自北京同仁堂科技股份有限公司，按常规方法煎煮、浓缩，一次性煎出，按“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”配制低、中、高剂量药液，分别为每毫升含原药材0.234、0.468、0.936 g，4 ℃冰箱保存备用。戊酸雌二醇片，拜耳药业，批号219A2，按l mg/（人·d），根据小鼠与人的体表面积进行换算，用三蒸水溶解药片，制成溶液，调整浓度，每毫升溶液含戊酸雌二醇0.009 mg。

1.3  主要试剂与仪器

小鼠透明带多肽溶液：根据小鼠透明带3（Zp3）的第 330～342个氨基酸序列，合成透明带多肽，分析纯度>90%，杭州多肽生化有限公司;血清促卵泡生成素（FSH）、抗苗勒氏管激素（AMH）、促黄体生成素（LH）及雌二醇（E₂）ELISA试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司;弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，美国Sigma公司。病理组织切片机（LEICARM2025，德国Leica公司），高分辨显微镜（BX43，日本奥林巴斯公司），电子天平 （FAZ104，上海速展计量仪器有限公司），生物组织自动脱水机（TS-12F，湖北省孝感市宏业医用仪器厂），病理组织包埋机和包埋冷冻台（BMJ-M，常州市中威电子仪器有限公司），自动放免测量仪（FT-613，北京核仪器厂），Thermo酶标仪（MK3，上海赛默生物科技发展有限公司），荧光定量PCR仪、转移电泳槽（VE-186，上海天能公司），电泳仪（PowerpacHC，美国伯乐高公司）。

2  实验方法

2.1  造模

雌性小鼠均经阴道脱落细胞涂片筛查，性周期正常。随机挑选10只作为空白组，其余50只用于造模。称取6 mg ZP3透明带多肽粉末，加6 mL双蒸水配成溶液，与弗氏完全佐剂按1∶1比例配制免疫试剂，与弗氏不完全佐剂按1∶1比例制成免疫强化试剂。按文献[5]方法小鼠予0.15 mL/只免疫试剂多点注射腹腔皮下，14 d后予免疫强化试剂0.15 mL/只再次多点注射小鼠腹腔皮下加强免疫。空白组每次造模时予0.15 mL/只生理盐水注射腹腔皮下。注射完成后，观察小鼠腹部肿胀情况，判断造模试剂吸收情况。

2.2  分组及给药

成模后50只小鼠随机分为模型组、阳性药组和毓麟珠高、中、低剂量组，每组10只。于造模后15 d开始灌胃给药，空白组和模型组给予生理盐水0.3 mL/次，阳性药组给予戊酸雌二醇片水溶液0.3 mL/次，毓麟珠高、中、低剂量组给予药混悬液0.3 mL/次。1次/d，连续6周（每周休息1 d）。

2.3  取材

给药前称重，之后每周称重并记录，第43日标本处理取材前再称重，心脏穿刺取血，处死动物，常规无菌方法留取卵巢、子宫称重，将一侧卵巢组织迅速投入液氮中，另一侧放入甲醛固定，待用。

2.4  双侧卵巢相对质量测定

常规无菌方法留取卵巢、子宫，用冰冷生理盐水清洁，滤纸干燥，然后称重，计算小鼠器官相对质量[器官质量（mg）÷体质量（g）]

2.5  HE染色

将甲醛固定的卵巢组织梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，脱蜡，常规HE染色，光镜下观察。

2.6  血清促卵泡生成素、抗苗勒氏管激素、促黄体生成素及雌二醇测定

将小鼠血液标本静置，离心，取血清，ELISA检测FSH、AMH、LH和E₂的含量。严格按照试剂盒说明书操作。

2.7  Western blot检测卵巢组织AKT、mTOR蛋白表达

提取小鼠卵巢组织蛋白，测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE，然后转膜。将PVDF膜以3%BSA 37 ℃封闭1 h，再分别用AKT和mTOR兔抗鼠多克隆抗体（1∶200）37 ℃孵育1.5 h，洗膜，加ALP标记的山羊抗兔IgG（1∶500）37 ℃孵育1 h。然后加NBT/BCIP避光显色。以β-actin作为内参照，应用IPP6.0软件分析。

2.8  实时荧光定量PCR检测卵巢组织Rheb、S6k1、4E-BP1 mRNA表达

按照常规方法提取小鼠卵巢组织RNA，提取后RNA进行浓度测定，使用2 μg RNA进行反转录，体系为50 μL。反应结束后，进行RT-PCR反应，反应结束后，分析Ct值，以GAPDH为内参照，采用2^-ΔΔCt法分析。

3  统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以x（—）±s表示，数据先做正态分布检验。若符合正态分布，组间差异比较采用方差分析，方差齐用LSD法，方差不齐采用Tamhane"T2法;若不符合正态分布则采用非参数统计中多个独立样本Kruskal-Wallis H检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4  结果

4.1  小鼠模型评价

小鼠阴道涂片观察显示，空白组小鼠动情周期正常，模型组小鼠动情周期发生紊乱。肉眼观察，可见空白组小鼠阴道分泌物黏稠呈拉丝状，模型组小鼠阴道分泌物较为稀薄。镜下观察，可见空白组小鼠动情期细胞较为均质，角化上皮细胞呈落叶状堆积;模型组小鼠动情周期紊乱，动情期细胞不均质，有多种细胞混杂，如角化上皮细胞、白细胞和淋巴细胞等。

4.2  毓麟珠对模型小鼠卵巢组织形态的影响

肉眼观察发现，造模后小鼠卵巢体积较空白组明显缩小，且形态细长，模型组可见部分卵巢组织与周围组织粘连。光学显微镜下观察发现，与空白组比较，模型组小鼠卵巢体积减小，卵泡数量减少，卵巢间质淋巴细胞浸润，部分透明带缩小，颗粒细胞排列紊乱，卵细胞形态畸形，缩小或消失;与模型组比较，各给药组，卵巢大小有所增加，卵泡数量增加，卵细胞形态改善，毓麟珠高剂量组改善最明显。见图1。

4.3  毓麟珠对模型小鼠体质量及器官相对质量的影响

各组小鼠体质量变化不显著。与空白组比较，模型组小鼠卵巢、子宫质量均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;与模型组比较，阳性药组和毓麟珠高、中、低剂量组小鼠卵巢、子宫质量均增加，部分差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），各给药组小鼠卵巢相对质量均增加，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），各给药组小鼠子宫质量和子宫相对质量有不同程度增加，毓麟珠中剂量组增加最明显，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。

4.4  毓麟珠对模型小鼠血清促卵泡生成素、促黄体生成素、抗苗勒氏管激素和雌二醇水平的影响

与空白组比较，模型组小鼠血清FSH、LH明显升高，AMH、E₂明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，各给药组小鼠血清FSH、LH均下降，AMH、E₂均升高，部分差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表2。

4.5  毓麟珠对模型小鼠卵巢组织mTOR、AKT 蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组小鼠卵巢组织mTOR、AKT蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;与模型组比较，毓麟珠高剂量组和阳性药组小鼠卵巢组织mTOR、AKT蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见图2、表3。

4.6  毓麟珠对模型小鼠卵巢组织Rheb、S6k1、4E-BP1 mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组小鼠卵巢组织Rheb、S6k1、4E-BP1 mRNA表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，各给药组小鼠卵巢组织Rheb、S6k1、4E-BP1 mRNA表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表4。

5  讨论

研究表明，mTOR通路参与细胞生长、增殖和分化的调节，与卵泡发育关系密切^[6]。其上游AKT下调细胞凋亡过程，还可促进细胞进入增殖周期。mTOR的激活与PI3K密切相关，AKT是PI3K的下游效应因子，AKT同时也是mTOR激活的关键因子，雌激素能够激活PI3K的活性，导致E₂和LH的水平变化，进一步反馈性调节FSH、LH的分泌。mTOR主要通过调节这2个靶蛋白对蛋白质的翻译进行调控，加速细胞G1/S期的转换，促进细胞生长和增殖，激活mTORC1，增强其下游Rheb、S6k1、4E-BP1的活性來增强卵母细胞内的蛋白转录，促进卵泡的发育，说明mTOR信号通路参与调控哺乳类动物卵巢卵母细胞的激活过程^[7]。

毓麟珠源自《景岳全书·妇人规》，为调经种子之方，该方由八珍丸加菟丝子、杜仲、鹿角霜、花椒组成。方中四君益气，有阳动之性;四物养血活血，有阴静之能;菟丝子、鹿角霜、杜仲、花椒有温养之势，既可助四君温肾阳益火之源，改善卵巢血流动力，发挥“形不足者温之以气”之功，又可助四物滋肾阴壮水之主，改善卵泡质量，发挥“精不足者补之以味”之效，达到恢复卵巢功能的目的。临床应用此方加减治疗POF取得很好疗效，尤其对于卵巢功能下降所致的不孕效果更佳。前期课题组研究表明，毓麟珠通过上调卵泡及卵巢间质 Bcl-2蛋白的表达，下调Bax蛋白的表达，抑制卵泡的过快凋亡，从而改善卵巢功能^[8]。

本研究发现，免疫性POI小鼠FSH升高，AMH下降，抑制了mTOR信号通路活性，卵巢变小，质量下降，卵泡数量减少。给予毓麟珠6周后，通过温肾阳益火之源使mTOR信号通路中mTOR、AKT蛋白表达量增加，提示造模药物可下调模型组小鼠卵巢组织蛋白水平，抑制信号通路的活性，而毓麟珠可上调模型大鼠卵巢组织mTOR、AKT蛋白水平，激活信号通路，促进卵泡发育。通过滋肾阴壮水之主使其下游Rheb、S6k1、4E-BP1 mRNA表达量升高，促使E₂分泌恢复到正常水平，促进AMH恢复，使FSH逐渐下降，卵泡数量增加，卵巢功能改善，对POI的防治有促进作用。说明毓麟珠通过补肾育卵之效激活mTOR通路，对改善卵泡微环境有促进作用，方中诸多药物如熟地黄、菟丝子、杜仲、人参等通过补肾益气，增强卵巢分泌功能及机体免疫力，并延缓衰老;当归、川芎养血活血能改善卵巢血流。前期临床研究显示，该方调节卵巢分泌功能，对于脾肾阳虚型POF卵巢功能改善作用明显^[9]，本研究结果也进一步阐释了其作用机制。

综上所述，毓麟珠可通过提高mTOR信号通路的相关蛋白的活性，正常发挥其促增殖分化的生物学作用，促进颗粒细胞增殖，分泌性激素，抑制卵泡过度闭锁，进而促进卵泡的生长发育，使受损的卵巢功能得以修复，成为增加原始卵泡储备、延长卵巢寿命及治疗卵巢相关疾病的一个重要靶点。结合离体研究的其他指标，为中药防治POI、改善卵泡发育的研究提供了依据，也为进一步分析中药的作用靶标及其分子生物学机制的深入研究奠定了基础。

参考文献：

[1] 中华医学会妇产科学分会绝经学组.早发性卵巢功能不全的激素补充治疗专家共识[J].中华妇产科杂志，2016，51（12）：881-886.

[2] NEWSON L R， LEWIS R. Premature ovarian insufficiency： why is it not being diagnosed enough in primary care [J]. Br J Gen Pract， 2018，68（667）：83.

[3] SUN X， SU Y， HE Y， et al. New strategy for in vitro activation of primordial follicles with mTOR and PI3K stimulators[J]. Cell Cycle，2015，14（5）：721-731.

[4] 曹婉宁，董晓英.mTOR通路通过促进卵泡发育改善卵巢早衰的机制研究进展[J].生殖医学杂志.2016，25（11）：44-47.

[5] 付莉，赵怡璇，李守柔.卵巢早衰实验动物模型的建立[J].生殖医学杂志，2006，15（3）：179.

[6] CHEN Z， KANG X， WANG L， et al. mTORC2 pathway in oocytes regulates folliculogenesis， and its inactivation causes premature ovarian failure[J]. J Biol Chem，2015，290（10）：6387-6396.

[7] REDDY P， LIU L， ADHIKARI D， et al. Oocyte-specific deletion of Pten causes premature activation of the primordial follicle pool[J]. Science，2008，319（5863）：611-613.

[8] 董曉英，柳顺玉，李冬华.补肾养血方对卵巢早衰小鼠凋亡调控蛋白Bcl-2/Bax的影响[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（1）：134-138.

[9] 董晓英，柳顺玉.毓麟珠治疗脾肾阳虚型卵巢早衰的临床观察[J].中华中医药学刊，2016，34（10）：2364-2366.

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