复合型脑肿瘤组织及细胞芯片的构建

材料与方法

1.1 材料

各种脑肿瘤组织共79例来自2003 -2013年定西市人民医院病理科库存标本，胶质瘤体外培养细胞20例来自苏州大学附属第二医院脑肿瘤研究室；蜂蜡购自常州市飞勒斯仪器有限公司；组织芯片仪为北京博医康实验仪器有限公司产品，该组织芯片仪包括操作平台（即底座板样品架），特殊打孔采样装置，前后左右上下移动和定位系统等组成。打孔与采样管刀的重合可由螺钉调整，方便，可靠。前后左右位移量有刻度显示和数字显示两种，方便、准确、直观。上下移动的下止点由螺栓挡块调整，保证打孔深度和样品柱放置的一致性。组织切片机为Leica公司产品；Rb鼠抗人多克隆抗体及免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 方法

1.2.1 芯片的设计 拟将脑肿瘤组织标本和体外培养的胶质瘤细胞布在同一载体上，载体选择经过特处理的玻片。在长45 mm×宽20 mm×高15 mm蜡块上构建12×10共120点阵芯，点阵间距0.6 mm。为了防止在打点、切片、染色或免疫组化过程中出现漏点，滑片及掉片现象，每个样本可以上样2个点，这样共布99个标本。起始2个位点空缺，作为起点标记。

1.2.2 培养脑肿瘤细胞块的石蜡包埋 将培养细胞收集在锥形离心管内，用2000 r/min速度离心5 min，弃上清液，加入适量的10%中性福尔马林，摇匀后置4 ℃冰箱内固定45 min，用1500 r/min速度离心2 min弃上清液，用PBS液洗涤2次。取适量微波炉加热溶解的2%琼脂糖滴于载玻片上，冷却至表面稍微凝固后用取样器吸取细胞注入琼脂糖内，待完全凝固后常规脱水、透明、浸蜡、包埋制成细胞蜡块。

1.2.3 空白微阵列蜡块的制备 取97.5 g莱卡石蜡+2.5 g蜂蜡（2.5%）混合，制成长45 mm×宽20 mm×高15 mm的空白蜡块，在该蜡块39 mm×16 mm范围内设计12×10点组织陈列。用组织芯片制作仪在受体蜡块上打孔，孔径1 mm。空白微阵列模块见图1。

1.2.4 含组织、细胞微阵列蜡块的制备 将空白微阵列模块放在56 ℃温控仪上烘10 min后，用打孔针从组织块上逐个取出靶标脑肿瘤组织，逐一放入预先设计的阵列模块中，然后用同样方法将培养的瘤细胞放入微阵列模块中，形成含有脑肿瘤组织和培养脑肿瘤细胞的复合微阵列块（图2）。将构建好的芯片蜡块放入55 ℃温箱中约10 min，在蜡将要完全溶解前，取出室温下冷却，使受体模块的蜡与新插入的小圆柱状组织溶为一体，取下蜡块，于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.5 切片 切片前，蜡块需在4 ℃中预冷4 h左右，然后夹在切片机上进行修正，等修到全部组织完整为止。用-20 ℃预冷冰袋贴在蜡块上5～10 min左右，快速连续切片30～50张，再用冰袋冷冻微阵列块，直至将组织切完为止。将4 μm连续切片分别漂在凉水中，让其自然展开，按顺序将切片转移至45 ℃的温水中展片2 min左右，将其贴在浸有切片黏合剂的载玻片上晾干，60 ℃中烤片3 min左右，58 ℃中继续烤片18 h，-20 ℃保存备用。

1.2.6 免疫细胞化学染色 对芯片进行一抗为Rb的免疫组织化学染色，采用EnVision法，由笔者所在医院病理科完成。

2 结果

成功制作118孔含99例脑肿瘤组织、细胞的微阵列蜡块，载玻片上点阵无脱落。HE切片显示取样组织边缘锐利，无明显组织挤压和结构变形，所取组织点阵符合研究要求（图3）。制作的芯片蜡块见图2，免疫组化染色见（图4）。

3 讨论

组织芯片是生物芯片技术的一个重要分支，是将许多不同个体组织标本以规则阵列方式排布于同一载玻片上，进行同一指标的原位组织学研究[6]。细胞芯片是将细胞按照特定的方式固定在载体上，用来检测细胞间相互影响或相互作用。单一的组织芯片或细胞芯片在实验研发和临床诊断工作中受到很大制约，不能进行组织及细胞间的比对研究，不能观察细胞内部结构，浪费昂贵的抗体，浪费时间等问题层出不穷。如何解决这个问题呢？经过长期研究，把细胞、组织，按照不同的目的要求，放置于同一载体上，制成相应的复合型组织及细胞芯片应运而生。复合型生物组织及细胞芯片在很多领域都有广泛的应用，它是在尽可能留取有用的生物信息基础上，把组织与细胞同时列阵于同一张载体，而细胞的来源可以是血液细胞或者是培养的细胞，处理方法则完全改变了传统涂片、细胞培养的方法，而是按照组织的处理方式，把细胞集群经过特殊固定液固定，使其蛋白质凝固，能够与组织标本形成相当硬度，然后，与组织一同经脱水、石蜡包埋成蜡块。再以组织芯片的制作方法，按照不同的课题要求，选取组织标本和细胞，列阵于载体上，以常规方法切片，完成复合型组织及细胞芯片的制作。目前虽有多种复合型组织及细胞芯片的构建方法，但都存在操作复杂，成本高昂等缺点。本研究把细胞蜡块包埋技术和组织芯片制作技术相结合，将体外培养的胶质瘤细胞及脑肿瘤组织标本构建在同一载体上，开辟了一种制作复合型组织及细胞芯片的方法。用这种方法制作的复合型组织及细胞芯片具有以下几个优点：（1）所需设备简单，制作技术成熟，易于推广应用；（2）细胞石蜡包埋切片，可以进行细胞内部生物信息的观察与探索，改变了以往只能观察细胞表面结构的缺陷。（3）细胞与组织的生物信息在同一载体上的比对研究，提供细胞及组织不同层面的生物信息；（4）将组织和细胞置于同一载玻片上，实验条件的同一性减少了实验误差，其对比性强；（5）采用全新的组织处理方法进行细胞的脱水、包埋、切片、列阵，重新诠释了细胞芯片的概念；（6）将培养脑肿瘤细胞与脑肿瘤组织纳入同一载玻片上，有利于阐明脑肿瘤与细胞之间的关系以及它们之间可能的相互转化机理。

本项目复合脑肿瘤组织及细胞芯片尚少见报道，该项目的成功开发，将产生系列产品和技术，在人体及动物医学的教学、基础科研、临床疾病诊断等众多行业得到应用，对生物芯片领域将起到巨大的推动作用。

参考文献

[1]朱卿，黄强，翟德忠，等.针对胶质瘤发生、发展分子机制研究的组织芯片制作[J].中华神经医学杂志，2006，5（4）：338-341.

[2]翟德忠，柴玲霞，冯万文，等.应用组织芯片技术构建细胞免疫芯片[J].中国现代医学杂志，2009，19（2）：213-215.

[3]霍红梅，翟德忠，朱卿，等.脑胶质瘤分子病因相关组织芯片CyclinB1表达及其临床意义的研究[J].中华肿瘤防治杂志，2008，15（13）：972-975.

[4]霍红梅，翟德忠，朱卿，等.神经胶质瘤组织芯片制作中影响因素的分析[J].临床与实验病理学，2008，24（4）：492-493.

[5]翟德忠，黄强，朱卿，等.细胞周期蛋白依赖性激酶CDC2在不同级别胶质瘤和瘤细胞系中的表达[J].中华病理学杂志，2007，3（36）：196-197.

[6]李学礼，潘云.手工制作组织芯片及体会[J].中国医学创新，2013，10（11）：128-129.

（收稿日期：2015-04-24） （编辑：金燕）

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