氨水提取联合陶瓷膜超滤技术纯化甘草苷工艺研究

对照品（纯度≥93.1%，批号111610-201106），中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 甘草苷含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 取甘草苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1 mL含甘草苷21 µg的对照品溶液，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 取甘草粉末（过3号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加70%乙醇100 mL，密塞，超声处理（功率250 W，频率40 Hz）30 min，放冷，转移并定容至100 mL容量瓶，0.45 µm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.3 甘草提取样品液的制备 精密吸取甘草样品液1 mL，置具塞锥形瓶中，加70%乙醇100 mL，密塞，超声处理（功率250 W，频率40 Hz）30 min，放冷，摇匀，转移并定容至100 mL容量瓶，经0.45 µm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.4 色谱条件与系统适用性试验 参照2015年版《中华人民共和国药典》（一部）[1]，以十八烷基硅烷键合硅膠为填充剂；流动相A为乙腈，B为0.05%磷酸溶液，梯度洗脱（见表1）；检测波长237 nm，柱温25 ℃，进样量20 µL。理论板数按甘草苷峰计算应不低于5000。

2.1.5 线性关系与范围 分别精密吸取1、2.5、5、10、15、20 µL甘草苷对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定。以峰面积为纵坐标，进样量（µg）为横坐标，作回归曲线，得回归方程Y=3039.6X+1.223 1，r2=0.999 9，线性范围为0.021～0.42 µg。

2.1.6 甘草样品液含量测定 将“2.1.3”项下样品液按“2.1.4”项下条件测定，代入回归方程计算。

2.2 提取工艺研究

2.2.1 提取溶剂的选择 根据生产实际的需要，分别选取水、3%氨水溶液为提取溶剂，以甘草苷提取率及提取液的出膏率为评价指标进行考察。甘草苷提取率（%）=（提取样品液中甘草苷含量÷供试品溶液中甘草苷含量）×100%。出膏率（%）=（提取物质量÷药材质量）×100%。提取方法：称取甘草饮片100 g，加入溶剂900 mL，回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液，浓缩至500 mL。按“2.1.6”项下方法测定甘草苷含量并计算，结果见表2。可见，3%氨水提取液的甘草苷提取率高于水提液，且出膏率低，考虑后续分离、精制的成本，最终选取3%氨水溶液为提取溶剂。

2.2.2 溶剂浓度的筛选 按“2.2.1”项下提取方法，考察氨水浓度分别为0.3%、0.5%、0.75%、1%、2%、3%时对甘草苷提取率的影响，结果见图1。可见，当氨水浓度为0.75%时，甘草苷提取率达到最高，之后随着氨水浓度的增大，提取率不再增加，从节约生产成本和提高提取效果出发，选取0.75%氨水溶液为提取溶剂。

2.2.3 提取工艺正交试验 以甘草苷提取率为指标，选取氨水用量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）为考察因素，采用L9（34）正交设计优选甘草苷最佳提取条件。因素水平见表3，正交试验结果见表4，方差分析见表5。

由直观分析和方差分析结果可知，影响甘草苷提取率的各因素重要次序为氨水用量（A）>提取时间（B）>提取次数（C），且因素A、B、C对甘草苷提取率均有显著影响。优化的提取条件为A3B2C3，即0.75%氨水24倍，回流提取3次，每次60 min。

2.2.4 提取工艺验证试验 称取3批甘草饮片，各300 g，按筛选的最佳工艺A3B2C3平行提取3次，测得甘草苷提取率分别为72.4%、71.7%、72.9%，平均提取率为72.3%，RSD<3%，说明该工艺稳定可行。

2.3 超滤工艺研究

2.3.1 提取液的制备 按上述最佳提取工艺，分别称取甘草饮片1.6 kg制备甘草苷提取液，放置过夜后取上清液，剩余药液经3000 r/min离心15 min，收集上清液，将2次上清液合并，备用。

2.3.2 超滤工艺正交试验 根据本课题组的前期研究[5-6]，以甘草苷保留率、除杂率为评价指标，采用L9（34）正交设计对超滤膜孔径（A）、操作压力（B）、料液温度（C）进行优化，因素水平见表6，正交试验结果见表7，方差分析结果分别见表8、表9。除杂率（%）=（未超滤样品出膏率-超滤样品出膏率）÷未超滤样品出膏率×100%。保留率（%）=超滤透过液中甘草苷含量÷未超滤液中甘草苷含量×100%。

由直观分析可知，影响指标的因素重要次序分别为甘草苷保留率B>A>C、除杂率A>B>C；较好的因素水平组合分别为甘草苷保留率A3B2C1、除杂率A1B2C3。通过方差分析可知，因素B对甘草苷保留率和除杂率均有显著影响，则选取第2水平较好；而因素A只对除杂率有显著影响，则选取第1水平较好；因素C对两者均无显著影响，但从节约成本和实际操作的便利考虑，选择第1水平较好。综合分析，最终选取A1B2C1为最佳超滤工艺，即10 nm无机陶瓷膜在压力0.12 MPa和料液温度25 ℃条件下进行超滤。

2.3.3 超滤工艺验证试验 分别称取同一批甘草饮片各3.2 kg，共3批，按“2.3.1”项下操作后，按最佳超滤工艺A1B2C1进行验证，甘草苷保留率分别为98.6%、98.9%、99.1%，除杂率分别为22.9%、23.3%、23.7%，甘草苷平均保留率为98.9%，超滤过程平均除杂率为23.3%，均RSD<3%，说明该工艺稳定可操作。

3 讨论

本研究选用0.75%氨水提取甘草苷时，其提取效果与文献报道的乙醇提取效果[7-9]相近，但提取成本远低于乙醇提取。由于以氨水为提取溶剂可溶解的大分子杂质多，会造成甘草苷的后续纯化、精制困难，所得产品纯度较低。针对上述缺点，本研究将超滤技术与氨水提取工艺联用，在保留甘草苷的同时，有效除去了氨水提取出的大分子杂质，可保证甘草苷提取物纯度。

由于中药提取液中大分子亲水物质及无机离子等易产生死吸附，对超滤膜造成不可逆的污染，制约了超滤技术在中药产业化的应用。文献报道，甘草有效成分的超滤纯化多选用有机超滤膜[10-12]，但有机膜除热稳定性差、机械强度低、易变形等缺点外，在纯化中药提取液的过程中易形成永久性污染，使用寿命短，导致在工业化应用时成本极高。为解决工业生产适用性问题，本研究采用的无机陶瓷超滤膜机械强度高、化学稳定性好，在高速错流条件下用苛性化学清洗剂冲洗可解决膜污染问题，有效地延长了膜使用寿命。

由于膜组件在临界压力以下过滤时可有效防止膜表面不可逆污染的形成，因此，本试验依据课题组前期的研究基础[5-6]，在工艺优化设计过程中，将滤过压力的最大取值设在临界压力以下，保证所优化出的超濾工艺其工作压力低于临界通量压力，该工艺在工业生产时，可有效延长膜的清洗周期和使用寿命。

本研究以氨水为提取溶剂，可同时得到甘草苷和甘草酸，并通过超滤技术除去了大部分大分子杂质，使料液黏度大幅度降低，为后续采用固体膜萃取技术[13]进一步分离甘草酸和甘草苷奠定了基础。

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（收稿日期：2016-08-13）

（修回日期：2016-10-10；编辑：陈静）

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