鱼类白介素（IL—1β）及干扰素（IFN）重组质粒构建及联合应用研究

材料与方法

1.1 实验材料

试验用鱼：试验鲤鱼购自吉林省土著鱼类良种场。虹鳟鱼中试试验应用于和龙青龙渔场。

基因片段合成：NCBI下载鲤鱼细胞因子IL-1β及IFN基因序列，根据物种（虹鳟）进行优化处理，委托上海生物工程有限公司合成，IL-1β基因全长840bp，IFN基因全长573bp，序列5’端和3’端分别添加BgⅢ和EcoR I酶切位点。

载体：pIRES2-EGFP购自invitrogen公司。

细胞：Hela细胞由中国军事医学科学院军事兽医研究所提供。

主要试剂：限制性内切酶BgⅢ和EcoR I，T4 DNA连接酶，Ex Taq DNA Polymerase，购自TaKaRa公司。Trizol Reagent购自上海生物工程有限公司。质粒提取试剂盒，购自Axygen公司。SDS-PAGE试剂购自北京鼎国生物科技有限公司。

1.2 基因合成、克隆与鉴定

将人工合成的白介素（IL-1β）及干扰素（IFN）基因分别进行BgⅢ和EcoR I双酶切后与同样酶切的pIRES2-EGFP载体连接，分别构建pIRES2-EGFP- IL、pIRES2-EGFP- IFN荧光质粒，分别命名为A3777-1和A3777-2。连接产物转化感受态DE3菌，涂布于含卡那霉素的LB固体培养基上，37℃恒温培养过夜，筛选阳性克隆，从每个培养皿上各挑取6个单菌落接种于4ml含卡那霉素抗性的LB培养液中，37℃恒温摇床培养过夜，用试剂盒小量提取质粒。

用BgⅢ和EcoR I双酶切所得质粒进行鉴定。同时对所得质粒进行测序鉴定。

1.3 核酸疫苗的制备及免疫

1.3.1 核酸疫苗制备

对鉴定结果准确的质粒进行大量提取，作为免疫用核酸疫苗。

1.3.2重组质粒转染细胞

在细胞培养板中接种传代Hela细胞1×105～3×105个/ml，当细胞单层铺满孔底60%时，弃营养液，PBS洗涤备用。将DOTAP Liposomal加入500μl MEM中轻轻混匀，另取500μl MEM加入10μg重组质粒DNA混匀（同时设立空载体DNA作为空白对照），将后者缓慢滴加于前者中轻轻混匀，室温作用30min，加入细胞板内，置于CO2培养箱37℃作用8～10h，补加含2% FCS的MEM，继续培养48～72h。弃上清，倒置于荧光显微镜下观察。

1.3.3 免疫

于试验前两周，选取规格在20厘米左右，健康无病的同一批次鲤鱼于控温在19-22℃的水族箱中充氧饲喂。试验组共30尾，分为两组，15尾/组，分别腹腔注射A3777-1和A3777-2各50μg，同时腹腔注射空载体10尾为空白对照组。

免疫后第2周抽样收集试验组和对照组腹水及肌肉组织和血清样本。腹水样品在荧光显微镜下观察，确定质粒在鱼体内表达情况。两试验组每组采集10尾肌肉组织，对照组采集2尾肌肉组织样品，应用RT-PCR法检测质粒在组织中的表达情况。收集的血液样本，分离血清，应用SDS-PAGE法检测血清中抗体产生情况。

1.3.4 中试试验

将所提取质粒肌肉注射免疫待产虹鳟亲鱼，注射剂量仍为每种质粒50μg。在人工授精过程中，在5kg鱼卵中混入同样的两种质粒各500μg进行二次免疫，待受精卵破膜后，抽样采集虹鳟幼鱼，应用荧光显微镜检测目的蛋白表达情况。并计算繁殖成活率。

2 结果

2.1 基因合成、克隆与鉴定

人工合成的IL-1β及IFN基因BgⅢ和EcoR I双酶切产物与pIRES2-EGFP载体连接，构建A3777-1和A3777-2两株质粒。用BgⅢ和EcoR I双酶切所得质粒，1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。结果显示，A3777-1在840bp和5300bp处同时出现条带;A3777-2在573bp和5300bp处同时出现条带（见图1）。同时对所得质粒委托上海生物工程公司进行测序鉴定。鉴定结果显示，所得质粒正确。

2.2 核酸疫苗的构建

大量提取所得质粒，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定（见图2），紫外分光光度计定量显示所得质粒约为A3777-1 124 ng/μl;A3777-2 83 ng/μl。

Fig.2 A large number of extraction of plasmid gel electrophoresis（M：marker;1：A3777-1;2：A3777-2）

2.3 重组质粒转染细胞

DOTAP Liposomal与质粒DNA混合物加入在细胞培养板中接种传代的Hela细胞后，置于CO2培养箱37℃作用8～10h，补加含2%FCS的MEM，继续培养48～72h。弃上清，倒置于荧光显微镜下，可见A3777-1和A3777-2质粒转染的细胞均可见荧光反应，空白对照无荧光显示，如图3所示。

图3.质粒DNA转染Hela细胞图片（A：A3777-1;B：A3777-2;C：空白对照）

Fig.3 Fluorescent photos of Hela cells transfected by plasmids DNA（A：A3777-1;B：A3777-2;C：control）

2.4 免疫荧光检测

免疫后第2周收集两试验组和对照组腹水，在荧光显微镜下观察，可见两试验组均有荧光可见，对照组无荧光（见图4）。肌肉组织样品RT-PCR结果显示，两试验组采集的各10尾肌肉组织样品中，A3777-1组的10尾样品在840bp处均有目的条带出现，A3777-2组的10尾样品在573bp处亦均有目的条带出现，对照组2个样品无目的带（见图5）。血清样品SDS-PAGE结果显示，两试验组在40KD处均有目的条带产生，对照组无目的条带（见图6）。通过以上3组试验结果证实，本研究制备的两组质粒疫苗在鱼体内均获得了良好的表达。

2.5 中试试验

所提取质粒肌肉注射免疫待产虹鳟亲鱼。人工授精过程中进行二次免疫。抽样采集虹鳟幼鱼，应用荧光显微镜检测目的蛋白表达情况，试验鱼可见明显的荧光反应，对照组无荧光显示（见图5）。试验组卵粒共5.5kg，约合5.28万粒，共繁殖虹鳟鱼苗4.85万尾，成活率97%。空白对照组卵粒共25.5kg，约合24.48万粒，共繁殖虹鳟鱼苗13.44万尾，繁殖成活率56%。可见试验组繁殖成活率显著提高。

3 讨论

核酸疫苗的免疫效果与目的基因序列、载体、佐剂、免疫途径等多种因素有关。在目的基因选择过程中，考虑到鱼类的生活环境造成其易受各种致炎因子刺激发生炎症乃至死亡，因此既要增强鱼体抗菌能力，又要增强鱼体抗病毒能力，最终选择白细胞介素（IL）和干扰素（IFN）。其中白介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。由活化的巨噬细胞所产生，能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能。当鱼类受细菌感染引起炎症反应时，机体最早分泌的抗炎症细胞因子中包含有IL-1β。有研究认为IL-1β在鱼类皮肤免疫中具有重要作用。其重组蛋白亦可引发机体免疫应答反应，如虹鳟（oncorhynchus mykiss）IL-1β重组体经腹腔注射可有效抵御杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）感染。Sigh等证实了虹鳟感染多子小瓜虫过程中有促炎细胞因子IL-1β受体的表达，感染4天后，与未感染的对照组相比，感染鱼的皮肤中IL-1β的表达增加了17.8倍。因此，本研究选择IL-1β作为目的基因之一。在选择能够增强鱼体抗病毒能力基因过程中，查询相关资料，研究人员选择干扰素作为本研究的第二个目的基因。干扰素主要由病毒诱导产生，能够诱导动物进入抗病毒状态。干扰素不能直接灭活病毒，而是通过诱导细胞合成抗病毒蛋白（AVP）发挥效应，是机体防御反应中出现最早的防御系统。本研究直接将干扰素基因作为核酸疫苗免疫鱼体，直接激活细胞基因表达多种抗病毒蛋白，实现对病毒的抑制作用。鱼类干扰素研究起步晚，但进展迅速。迄今为止，已陆续从虹鳟、牙鲆、草鱼、黑鲫等多种鱼类中发现了IFN。另有研究发现草鱼IFN主要由头肾等免疫组织中的淋巴细胞产生， 除了抗病毒活性外，还具有促进巨噬细胞吞噬杀菌、调节淋巴细胞转化等功能。在鱼类IFN基因克隆方面，由于鱼类IFN基因和已知的哺乳类、鸟类等IFN基因同源性较低，所以设计有效的引物用PCR或者探针筛选文库等方法获得该基因比较困难，因此本研究选择人工合成方法来完成干扰素基因的合成，并进行物种优化后作为目的基因。

本研究首先将构建的两种质粒转染Hela细胞，验证两种质粒在细胞内的表达情况。进一步将两种质粒分别注射到鲤鱼体内，通过鲤鱼腹水中荧光信号的有无及肌肉组织RT-PCR检测结果和SDS-PAGE血清验证结果，三者共同来验证所构建质粒在鱼体内的表达情况，结果显示，免疫试验鱼腹水内明显可见荧光信号，而对照鱼腹水无荧光信号。两试验组各取10尾肌肉组织RT-PCR均可见目的片段，空白对照组肌肉无目的带;血清凝胶电泳也证实两试验组在40KD处可见目的条带，空白组无此条带。通过以上诸多结果证实了所构建的质粒在鱼体内可以获得表达。将两种质粒混合注射免疫虹鳟待产亲鱼，并在人工授精过程中进行二次免疫。待幼鱼孵化出后进行荧光检测，检测结果最终证明所构建的质粒在虹鳟体内表达情况良好，同过试验组和对照组繁殖成活率对照进一步证实，试验组成活率达到97%，对照组仅为56%，足足提高了41%。上述几项实验结果可以证明，本研究所构建的质粒无论在人工培养的细胞还是鱼体内均能活动较理想的表达，可以明显的提高机体的自身免疫力。

虹鳟是全球养殖普遍的鲑鳟鱼类，但其病毒病也是世界难题，染病虹鳟苗种死亡率常达99%。常规手段是捕杀、隔离、彻底消毒，损失惨重。物理和化药防治受条件和药残危害的限制，抗原疫苗研制和应用刚刚起步，技术不成熟，有返毒危险。本研究属于无毒无残留的生物防治技术，通过提高鱼体的自身免疫力对抗病毒和细菌，不仅可以避免上述危害，还将保护该产业发展。

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