团头鲂黑素皮质素受体2基因克隆、组织分布和应激后的表达分析

摘要：在神经内分泌下丘脑-垂体-肾间组织轴调控中，黑素皮质素受体2（MC2R）与垂体释放的促肾上腺皮质激素结合而激活相应的cAMP信号转导途径，对鱼类的应激反应调控具有重要的作用。本研究通过PCR、RACE技术克隆获得团头鲂MC2R mRNA序列，并通过实时定量PCR分析了团头鲂MC2R组织分布情况及捕捞胁迫后的表达变化。结果显示，获得的MC2R mRNA序列开放阅读框为915 bp，编码304个氨基酸。序列同源性及系统育分析显示，团头鲂MC2R氨基酸序列与鲤科鱼类的MC2R聚为一支，与金鱼（Carassius auratus）MC2R的氨基酸序列同源性最高（87%）。组织分布结果表明，头肾中MC2R的表达量最高，脾脏、精巢和脑中有相对较高的表达量，中肾、肝、肠和肌肉等MC2R的表达量相对较低。经捕捞出水体60 s的急性应激处理后，皮质醇在4 h时显著升高，24 h时表现出下降的趋势；MC2R基因表达量在头肾中变化不显著，然而脾、脑和精巢中MC2R 在4 h时表达量相对于1 h则呈现出显著的下降。通过对团头鲂应激后主要调控因子变化规律的研究，可为鱼类应激后调控措施的实施提供参考依据。

关键词：团头鲂；MC2R基因；皮质醇；克隆；组织表达；应激

中图分类号： S917文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0020-07

收稿日期：2014-03-11

基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金（编号：CARS-46-10）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（编号：2013JBFM10）。

作者简介：董晶晶（1989—），女，河南周口人，硕士研究生，主要从事水产动物营养与疾病防控的研究。E-mail：jingzsmx@163.com。

通信作者：谢骏，研究员，主要从事池塘微生态学、水产动物的应激机制、细菌性病害生态防控技术的研究。E-mail：xiej@ffrc.cn。团头鲂（Megalobrama amblycephala），又称武昌鱼，隶属于鲤形目（Cypriniformes）鲤科（Cyprinidae）鳊亚科（Abramidinae）鲂属（Megalobrama），是中国主要的淡水养殖品种之一。但团头鲂鱼体应激反应强，抗应激能力低下，在拉网卖鱼以及运输过程中鱼体由于应激经常出现“发毛发红”，体表黏液减少或无黏液等现象，有时甚至导致鱼体死亡，严重影响养殖经济效益。鱼类应激反应与其他脊椎动物类似，受下丘脑-垂体-肾间组织轴（HPI）的调控，在应激源刺激后，下丘脑中枢神经系统释放促肾上腺皮质激素释放激素（corticotrophin-releasing hormone，CRH）作用于有促皮质激素细胞分布的垂体前外侧部，由促皮质激素细胞中的阿片-促黑素细胞皮质素原（proopiomelanocortin，POMC）前体肽经加工处理生成促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH），进而调控鱼类重要皮质激素——皮质醇的合成，皮质醇释放到血液中，调节呼吸系统、心血管系统、能量代谢系统等相应组织器官中的反应变化[1-3]。

黑素皮质素受体2（melanocortin 2 receptor，MC2R）是一种具有7个跨膜α螺旋结构的G蛋白偶联受体，在ACTH刺激皮质醇合成分泌的过程中，MC2R与ACTH特异性结合，使得相应的cAMP信号转导途径激活，对脊椎动物皮质醇合成和释放的调控具有重要意义。MC2R在鼠的肾上腺发育以及类固醇合成中发挥着不可替代的作用，鼠MC2R的失活突变，使得高浓度ACTH也不能刺激皮质醇的合成，甚至对ACTH刺激不能产生应答反应[4]。

目前MC2R的激活及其配体结合能力在包括鱼类等多种脊椎动物中得到了广泛的研究[5-8]。研究发现，MC2R是5种黑素皮质素受体（MC1R、MC2R、MC3R、MC4R和MC5R）中最特殊的，主要表现为：（1）其细胞膜表达以及功能的激活均需要黑素皮质素受体2辅助蛋白1型（MRAP1）的协助；（2）MC2R只特异性地与ACTH结合而被激活，不能结合黑素细胞刺激素（MSH）等多肽（α-，β-，γ-and δ-MSH）。

MC2R在鱼类应激中的作用研究相对较少，对于应激源刺激下MC2R的表达变化，以及ACTH或MSH相关肽类的刺激对皮质醇合成释放的影响虽已有部分研究[9-11]，但有机体在应激源刺激后的恢复阶段，机体调控使得MC2R表达以及皮质醇水平产生的变化还未见报道。由于鱼类在生长过程中不可避免会受到一定程度的刺激，了解应激后恢复阶段鱼体主要应激调控因子的变化状况，对于帮助鱼体快速恢复正常状态、避免不必要的二次损伤具有重要意义。因此，本研究通过反转录PCR、RACE扩增技术等获得团头鲂MC2R mRNA序列，分析了团头鲂MC2R的组织分布特点，并通过捕捞出水体60 s对团头鲂进行急性应激处理，探究团头鲂MC2R的组织表达以及血清皮质醇水平的变化，以期为团头鲂等鱼类应激后调控措施的实施提供一定的参考依据。

1材料与方法

1.1试验材料

以团头鲂为试验对象，所用团头鲂均由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心南泉基地提供，鱼体健康，体表无伤痕，形态正常、无畸形，游动能力强。

1.2试验设计

组织分布试验所用组织分别取自12条团头鲂，雌、雄各6条，体重（55.9±2.4） g，体长（15.4±0.1） cm，取表皮、肌肉、肠、脾、肝、中肾、头肾、鳃、心脏、脑、眼、精巢和卵巢等13种组织。采样前均采用终浓度为150 mg/L的MS-222在缸中对鱼体直接进行深度麻醉，快速解剖采取相应组织。

捕捞胁迫试验共取64条鱼，体质量（57.4±1.6） g，体长（15.3±0.2） cm，共分为4个组，每组2个缸，每缸8条鱼，于玻璃缸中适应2周后进行试验，处理条件为将鱼迅速捕捞至网内，并捞出水面60 s后放回水中，分别在胁迫前（设为 0 h）及捕捞胁迫后静置（恢复阶段）1、4、24 h采样，采样前采用终浓度为150 mg/L的MS-222在缸中对鱼体直接进行深度麻醉，快速尾静脉采血，并依据组织分布试验结果，采取MC2R主要表达组织头肾、脾、脑和精巢。

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